【摘要】： 目的 隱匿性HBV感染是HBV感染狀態(tài)中的一個特殊階段,其發(fā)生機制一直未能明確,病毒變異、宿主免疫應答、合并其他病原體感染、表觀遺傳學改變都是這個特殊感染狀態(tài)發(fā)生的可能機制。同時,慢性乙型肝炎患者經有效的抗病毒治療可以達到HBsAg清除,外周血HBV DNA可能檢測不到。這兩類人群在臨床血清學和病毒學指標上具有極大的相似之處。部分HBsAg清除的慢乙肝患者從某個程度上說可能屬于隱匿性HBV感染,而隱匿性HBV感染者的來源可以是急性肝炎恢復的患者、慢性乙型肝炎的治愈患者和HBsAg自然轉陰的慢性HBV攜帶者。然而,目前對于這兩種人群的HBV特異性細胞免疫學特點的報道尚缺乏。而明確這兩者的HBV特異性細胞免疫學特點,可能有助于我們更深入地認識隱匿性HBV感染的發(fā)生機制,以及洞察細胞免疫學因素在慢性乙型肝炎患者經有效抗病毒治療達到HBsAg清除的過程中發(fā)揮的相應作用。 方法 1.通過更敏感的化學發(fā)光微粒免疫法重新檢測982份合格獻血員的血漿,從中發(fā)現(xiàn)HBsAg≥0.05 IU/mL的標本；提取這些標本的HBV DNA,用診斷性PCR對HBV S、C和X區(qū)進行擴增,凡2個或以上區(qū)段擴增陽性的標本,可診斷為隱匿性HBV感染。在此基礎上,對部分擴增陽性的標本進行基因型分析和“a”決定簇變異分析。 2.從這些隱匿性HBV感染者中回訪到6名獻血員,并從門診和住院患者中發(fā)現(xiàn)了3名隱匿性HBV感染者,與14名經抗病毒治療達到HBsAg清除的慢乙肝治愈者進行細胞免疫學特點的分析。其中14名HBsAg清除者的血清HBVDNA也進行了基因型和病毒變異分析。 3.分離9名隱匿性HBV感染者和14名HBsAg清除者外周血單個核細胞(PBMC),用自行設計的涵蓋S和C基因區(qū)的18-mer重疊多肽庫(overlapping peptide pool)和重組HBsAg、HBcAg抗原作為特異性刺激物,通過酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)檢測T細胞特異性分泌IFN-y的能力；再用上述合成的重疊多肽庫作為特異性刺激物,刺激培養(yǎng)PBMC 6h,細胞內細胞因子染色(ICS)結合流式細胞術(FCM)檢測特異性分泌IFN-y和IL-2的CD4/CD8 T細胞陽性頻數(shù),明確特異性分泌細胞因子的T細胞來源。ELISPOT檢測IFN-y的斑點形成細胞數(shù)大于20 SFC/106 PBMC則視為陽性反應,陽性反應的平均SFC視為應答強度,陽性反應孔數(shù)占總體反應孔數(shù)的百分率視為應答反應性；ICS檢測IFN-γ和IL-2的CD4/CD8+T細胞頻數(shù)大于0.05%則視為陽性反應,陽性反應的平均細胞因子特異性CD4/CD8+T細胞頻數(shù)視為應答強度,陽性反應孔數(shù)占總體反應孔數(shù)的百分率視為應答反應性。 4.此外,7例免疫耐受HBV攜帶者和9例非活動性HBsAg攜帶者也作為慢性HBV感染對照組納入了本研究中分析細胞免疫學特點,所檢測的細胞免疫學指標同上。 結果 1.通過化學發(fā)光微粒免疫法檢測,發(fā)現(xiàn)64份血漿的HBsAg定量值≥0.05IU/mL,陽性率為6.5%(64/982)。64份HBsAg陽性標本,其中男性40份,女性24份；男、女獻血員的平均年齡比較無顯著差異(27±6VS.25±8,t=1.247,P=0.217)。64份HBsAg陽性血漿的平均HBsAg定量水平為0.28±0.27 IU/mL (0.05～1.14 IU/mL),其余918份血漿的平均HBsAg定量水平為0.02±0.01 IU/mL(0.00～0.04 IU/mL),兩組間平均HBsAg定量水平的比較有統(tǒng)計學差異(Z=-14.332,P0.001),而ALT水平的比較則無顯著差異(15.3±5.8VS.14.8±6.3,t=0.598,P=0.550),性別分布也無顯著差異(χ2=0.054,P=0.816). 2.64份HBsAg定量陽性(0.05 IU/mL)血漿經敏感的巢式PCR方法擴增HBV不同區(qū)段的產物,各區(qū)的總體擴增效率分別為：S區(qū)擴增陽性19例(29.7%),C區(qū)擴增陽性41例(64.1%),X區(qū)擴增陽性42例(65.6%)。其中僅一各區(qū)段擴增陽性的標本分別是：1例S區(qū)陽性(1.6%),7例C區(qū)陽性(10.9%),4例X區(qū)陽性(6.2%)。兩個區(qū)段以上同時陽性的標本分別是：12例三個區(qū)段均陽性(18.8%),21例C和X區(qū)同時陽性(32.8%),1例S和C區(qū)同時陽性(1.6%),5例S和X區(qū)同時陽性(7.8%)。此外,擴增全陰性標本有13例(20.3%)。按照隱匿性HBV感染的PCR診斷要求,只有兩個或以上區(qū)段擴增陽性的標本,才能被診斷為隱匿性HBV感染。在本次研究中,我們發(fā)現(xiàn)39名血站合格獻血員可被診斷為隱匿性HBV感染(4.0%,39/982)。 3.經序列比對分析,隱匿性HBV感染者S區(qū)擴增陽性的標本中并未發(fā)現(xiàn)“a=”決定簇的變異,特別是已有報道的熱點變異位點。有測序結果的14份樣品,經序列對比進行基因型分析,發(fā)現(xiàn)有6份為B型,其余8例為C型；在6名HBVDNA擴增陽性的HBsAg清除者中鑒定出5例為C型,1例為B型,均未發(fā)現(xiàn)“a”決定簇變異,但在2例C型患者中發(fā)現(xiàn)L80I、L180M和M204I三個位點聯(lián)合變異。 4.在ELISPOT檢測IFN-γ實驗中,HBV特異性T細胞均可以在HBsAg清除者和隱匿性HBV感染者外周血PBMC中檢測到,陽性反應孔的SFC頻數(shù)范圍分別為22～846 SFC/106 PBMC和22～504 SFC/106 PBMC,但兩者的陽性應答率無顯著差異(41.1% VS.33.3%,χ2=0.637,P=0.425),而且兩者的陽性反應孔的平均SFC頻數(shù)也無顯著差異(113±36 vs.98±31,P=0.976)。HBsAg清除者陽性反應孔的平均SFC高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.031)；隱匿性HBV感染者陽性反應孔的平均SFC高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.040)。此外,在HBsAg清除者組,rHBcAg比C多肽庫誘導的HBV特異性T細胞應答更強烈(P=0.012),但在隱匿性HBV感染者組,則兩種刺激物誘導的HBV特異性T細胞應答強度無顯著差異(P=0.302)。rHBcAg誘導的HBsAg清除者總體HBV特異性T細胞應答強于隱匿性HBV感染者(P=0.010),與非活動性HBsAg攜帶者相當(P=-0.549),但強于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.004)。血清陽性(anti-HBc陽性)隱匿性HBV感染者PBMC對S多肽庫、rHBsAg和rHBcAg呈低反應性,但對C多肽庫的反應性則較高(3/4)；血清陰性(anti-HBc陰性)隱匿性HBV感染者PBMC對S多肽庫、C多肽庫和rHBcAg的反應性均較高(均為3/5),但應答強度較離散,而對rHBsAg的反應性則為2/5,且應答強度較低。 5.總的來說,HBsAg清除者和隱匿性HBV感染者的外周血T細胞中可檢測到特異性分泌IFN-γ的CD8+和CD4+T細胞。HBsAg清除者與隱匿性HBV感染者的外周血IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)無顯著差異(P=0.103),但兩者的IFN-γ+CD4+T細胞頻數(shù)有顯著差異(P=0.047)。隱匿性HBV感染者IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.011)。HBsAg清除者的IFN-γ+CD4+T細胞頻數(shù)高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.023)。4個研究組的HBV特異性CD8+T細胞陽性應答強度的整體比較有顯著差異(χ2=9.132,P=-0.024),而對S和C多肽庫的反應性也不同。HBsAg清除者體外IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)體現(xiàn)出了對S和C多肽庫的反應性不同：C多肽庫的陽性反應率為78.6%(11/14,IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)范圍：0.06%～0.24%,Median:0.10%),而S多肽庫的陽性反應率為21.4%(3/14,IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)：0.08%、0.13%和0.24%)。隱匿性HBV感染者體外IFN-+CD8+T頻數(shù)則未發(fā)現(xiàn)對S和C多肽庫的反應性不同：C多肽庫的陽性反應率為42.8%(3/7,IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)范圍：0.08%～0.22%,Median:0.11%),S多肽庫的陽性反應率為28.6%(2/7,IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)：0.27%和0.38%)。免疫耐受HBV攜帶者CD8+T細胞對S多肽庫和C多肽庫的反應率分別為3/7(IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)范圍：0.06%～0.08%,Median:0.06%)和2/7(IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)：0.06%和0.07%);非活動性HBsAg攜帶者CD8+T細胞對S多肽庫和C多肽庫的反應率分別為4/9(IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)范圍：0.08%～0.32%,Median:0.135%)和6/9(IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)范圍：0.06%～0.23%,Median:0.085%).4個研究組的HBV特異性CD4+T細胞陽性應答強度的整體比較有顯著差異(χ2=8.628, P=0.035),而對S和C多肽庫的反應性也不同。4個研究組對S多肽庫的HBV特異性CD4+T細胞總體應答(全部應答)進行整體比較并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異(χ2=4.241,P=0.237),但對C多肽庫的總體應答的整體比較有顯著統(tǒng)計學差異(χ2=12.881,P=0.005)。HBsAg清除者體外CD4+T細胞對S和C多肽庫的反應性不同：C多肽庫的陽性反應率為11/14,S多肽庫的陽性反應率為4/14；盡管HBsAg清除者CD4+T細胞對兩種刺激物的陽性應答強度無統(tǒng)計學差異(Z=-0.987,P=0.324),但是在總體應答強度上卻有統(tǒng)計學差異(Z=-2.151,P=0.031)。隱匿性HBV感染者體外CD4+T細胞對S和C多肽庫的反應性和應答強度均較低,分別為2/7(IFN-γ+CD4+T細胞頻數(shù)：0.06%和0.07%)和3/7(IFN-γ+CD4+T細胞頻數(shù)：0.06%、0.07%和0.10%)；兩種刺激物誘導的CD4+T細胞總體應答強度無統(tǒng)計學差異(Z=-0.355,P=0.723),而陽性應答強度也無統(tǒng)計學差異(Z=-0.609,P=0.543)。免疫耐受HBV攜帶者體外CD4+T細胞對C多肽庫的刺激幾無應答(0/7),因此無法用統(tǒng)計學方法與隱匿性HBV感染者及HBsAg清除者進行比較；而對S多肽的反應性相對較好(3/7),但應答強度也是偏低(0.06%、0.06%和0.07%)。HBsAg清除者體外CD4+T細胞對C多肽庫的總體應答強度高于隱匿性HBV感染者和免疫耐受HBV攜帶者(Z=-2.254, P=0.024;Z=-3.257,P=0.001),與非活動性HBsAg攜帶者相當(Z=-0.823, P=0.411)；但隱匿性HBV感染者體外CD4+T細胞對C多肽庫的總體應答強度卻與免疫耐受HBV攜帶者及非活動性HBsAg攜帶者相比無顯著統(tǒng)計學差異(Z=-0.067,P=0.947;Z=-1.763,P=0.078)。血清陽性(anti-HBc陽性)隱匿性HBV感染者體外CD4+T細胞對S和C多肽庫的刺激幾無反應,僅有一人的CD8+T細胞對S多肽庫的刺激有反應性。血清陰性(anti-HBc陰性)隱匿性HBV感染者體外CD4+T細胞對S和C多肽庫的刺激均有反應(2/4和3/4),而CD8+T細胞對S和C多肽庫的刺激反應則不同(1/4和3/4),針對C多肽庫的CD4+和CD8+T細胞應答強度的比較無顯著差異(Z=-1.528,P=0.127)。 6.我們發(fā)現(xiàn)全部檢測對象經S或C多肽庫刺激后胞內檢測IL-2陽性T細胞應答具有非均一性。HBsAg清除者CD8+T細胞對S和C多肽庫的反應性均不高(4/14和2/14)；隱匿性HBV感染者CD8+T細胞對S多肽庫稍有反應(2/7),而對C多肽庫則無反應(0/7)；免疫耐受HBV攜帶者CD8+T細胞對S多肽庫的反應性較好(4/7),但對C多肽庫的反應性偏低(1/7)；非活動性HBsAg攜帶者CD8+T細胞對S多肽庫的反應性較低(2/9),對C多肽庫的反應性也較低(3/9)。HBsAg清除者CD4+T細胞對S和C多肽庫的反應性均偏低(均為1/14)；隱匿性HBV感染者CD4+T細胞對S多肽庫稍有反應(1/7),而對C多肽庫則無反應(0/7)；免疫耐受HBV攜帶者CD4+T細胞對S多肽庫的反應性較好(3/7),但對C多肽庫的反應性偏低(1/7)；非活動性HBsAg攜帶者CD4+T細胞對S多肽庫的反應性較低(2/9),對C多肽庫的反應性也較低(1/9)。用Kruskal-Wallis H test對CD8+T和CD4+T細胞應答進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)各組的IL-2+CD8+T細胞頻數(shù)的整體比較有統(tǒng)計學差異(χ2=8.269,P=0.041);而各組的IL-2+CD4+T細胞頻數(shù)的整體比較則無統(tǒng)計學差異(χ2=0.534)。 結論 HBsAg清除者外周血特異性T細胞應答不是由HBV外膜蛋白誘導的,HBsAg清除可能與HBsAg特異性T細胞免疫不相關,可能是HBV核心抗原誘導為主；血清陰性(anti-HBc陰性)和陽性(anti-HBc陽性)的隱匿性HBV感染者展示出不同的細胞免疫應答特點。隱匿性HBV感染者與HBsAg清除者的特異性T細胞應答特點有異同處,提示兩者達到HBsAg陰性的機制可能不同。從慢性HBV感染的自然史的階段分期結合細胞免疫學應答的特點來分析,我們有理由認為隱匿性HBV感染可能更多的來自急性乙型肝炎恢復者,而HBsAg清除的慢乙肝恢復者可能處于非免疫活動期,也可能處于恢復期,然而,這兩種狀態(tài)都可能因為機體免疫狀態(tài)的改變或病毒突破而導致HBV感染復燃,重新回到免疫激活期。尤其是HBsAg清除的慢乙肝恢復者,其長期的隨訪仍然是必需的,而且,從治療基線起始的臨床抗病毒治療隨訪,不同時間點進行細胞免疫學的動態(tài)分析,可能有助于我們摸索出更合理高效的抗病毒治療方案,同時也可能獲得一些免疫學指標用于臨床療效的預測。通過更敏感的HBsAg檢測法聯(lián)合anti-HBc抗體篩查或核酸檢測法(NAT)可以提高隱匿性HBV感染者的檢出率,進一步降低輸血和器官移植中發(fā)生隱匿性HBV感染的機會。
【圖文】：

乙型肝炎(hePatitisB)患者進展為肝臟功能失代償、肝硬化和肝細hepatocellularcareinoma，Hee)的風險遠高于健康人群，每年大概有50萬人因HBv感染引發(fā)的嚴重肝病死亡川。我國的HBv感染者約為1.中有2000一3000萬為慢性活動性肝病患者。全國每年死于與1」BV感染相約30萬人，據估計，我國每年因慢性乙型肝炎所帶來的直接經濟損失約為人民幣。不僅如此因為大眾對于HBV感染的認識尚存不足，使得HB者本人和家庭都要面對來自不同方面和不同程度的困難(入托、升學、嫁、生育等等)。因此，1」BV感染己經成為嚴重影響我國人民身心健康公的問題。最近幾十年對HBV病毒學和免疫學的理解不斷更新，，同時也伴敏感性檢測方法的出現(xiàn)，讓我們對HBV感染自然史有了新的認識。此外98年第一個口服抗病毒藥物獲準用于治療慢性乙型肝炎后，我們對乙型以進行有效的臨床管理。

前基因組在核心顆粒內逆轉錄為松弛環(huán)狀 DNA(relaxedeireularDNA，rcDNA)，一部分核心顆粒重新進入細胞核補充核內cccDNA池，其余核心顆粒與LHBs的Presl區(qū)結合，在內質網獲得包膜，再出芽分泌至細胞外(圖1一4)I’j。核心顆粒與LHBs是直接相互作用還是需要其它蛋白的參與目前還不清楚。‘口...賺孺知‘海，H“v辛S閱洲目目H吸栩.m‘滋西。。nud“，.......國畫姻四口圖1一4乙型肝炎病毒的生活周期Figurel一 4thelifecycleofhepatitisB、一lrus根據HBV全基因序列相差全8%或S基因序列差異全4%將HBV分為不同的基因型l5]。到目前為止一共鑒定了8個HBv基因型，分別為基因型A、B、C、D、E、F、G和H，血清型和基因型的對照及地理分布見表1一212，“]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)在HBV同一基因型內也存在著較大差異，并根據核普酸序列異質性全4%
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 Eva Billerbeck;Tobias B銉ttler;Robert Thimme;;Regulatory T cells in viral hepatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年36期

2 Patricia M Mulrooney-Cousins;Tomasz I Michalak;;Persistent occult hepatitis B virus infection:Experimental findings and clinical implications[J];World Journal of Gastroenterology;2007年43期

本文編號：2638102