【摘要】： 目的 隱匿性HBV感染是HBV感染狀態(tài)中的一個(gè)特殊階段,其發(fā)生機(jī)制一直未能明確,病毒變異、宿主免疫應(yīng)答、合并其他病原體感染、表觀遺傳學(xué)改變都是這個(gè)特殊感染狀態(tài)發(fā)生的可能機(jī)制。同時(shí),慢性乙型肝炎患者經(jīng)有效的抗病毒治療可以達(dá)到HBsAg清除,外周血HBV DNA可能檢測不到。這兩類人群在臨床血清學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)上具有極大的相似之處。部分HBsAg清除的慢乙肝患者從某個(gè)程度上說可能屬于隱匿性HBV感染,而隱匿性HBV感染者的來源可以是急性肝炎恢復(fù)的患者、慢性乙型肝炎的治愈患者和HBsAg自然轉(zhuǎn)陰的慢性HBV攜帶者。然而,目前對(duì)于這兩種人群的HBV特異性細(xì)胞免疫學(xué)特點(diǎn)的報(bào)道尚缺乏。而明確這兩者的HBV特異性細(xì)胞免疫學(xué)特點(diǎn),可能有助于我們更深入地認(rèn)識(shí)隱匿性HBV感染的發(fā)生機(jī)制,以及洞察細(xì)胞免疫學(xué)因素在慢性乙型肝炎患者經(jīng)有效抗病毒治療達(dá)到HBsAg清除的過程中發(fā)揮的相應(yīng)作用。 方法 1.通過更敏感的化學(xué)發(fā)光微粒免疫法重新檢測982份合格獻(xiàn)血員的血漿,從中發(fā)現(xiàn)HBsAg≥0.05 IU/mL的標(biāo)本；提取這些標(biāo)本的HBV DNA,用診斷性PCR對(duì)HBV S、C和X區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,凡2個(gè)或以上區(qū)段擴(kuò)增陽性的標(biāo)本,可診斷為隱匿性HBV感染。在此基礎(chǔ)上,對(duì)部分?jǐn)U增陽性的標(biāo)本進(jìn)行基因型分析和“a”決定簇變異分析。 2.從這些隱匿性HBV感染者中回訪到6名獻(xiàn)血員,并從門診和住院患者中發(fā)現(xiàn)了3名隱匿性HBV感染者,與14名經(jīng)抗病毒治療達(dá)到HBsAg清除的慢乙肝治愈者進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)特點(diǎn)的分析。其中14名HBsAg清除者的血清HBVDNA也進(jìn)行了基因型和病毒變異分析。 3.分離9名隱匿性HBV感染者和14名HBsAg清除者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),用自行設(shè)計(jì)的涵蓋S和C基因區(qū)的18-mer重疊多肽庫(overlapping peptide pool)和重組HBsAg、HBcAg抗原作為特異性刺激物,通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測T細(xì)胞特異性分泌IFN-y的能力；再用上述合成的重疊多肽庫作為特異性刺激物,刺激培養(yǎng)PBMC 6h,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測特異性分泌IFN-y和IL-2的CD4/CD8 T細(xì)胞陽性頻數(shù),明確特異性分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞來源。ELISPOT檢測IFN-y的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)大于20 SFC/106 PBMC則視為陽性反應(yīng),陽性反應(yīng)的平均SFC視為應(yīng)答強(qiáng)度,陽性反應(yīng)孔數(shù)占總體反應(yīng)孔數(shù)的百分率視為應(yīng)答反應(yīng)性；ICS檢測IFN-γ和IL-2的CD4/CD8+T細(xì)胞頻數(shù)大于0.05%則視為陽性反應(yīng),陽性反應(yīng)的平均細(xì)胞因子特異性CD4/CD8+T細(xì)胞頻數(shù)視為應(yīng)答強(qiáng)度,陽性反應(yīng)孔數(shù)占總體反應(yīng)孔數(shù)的百分率視為應(yīng)答反應(yīng)性。 4.此外,7例免疫耐受HBV攜帶者和9例非活動(dòng)性HBsAg攜帶者也作為慢性HBV感染對(duì)照組納入了本研究中分析細(xì)胞免疫學(xué)特點(diǎn),所檢測的細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)同上。 結(jié)果 1.通過化學(xué)發(fā)光微粒免疫法檢測,發(fā)現(xiàn)64份血漿的HBsAg定量值≥0.05IU/mL,陽性率為6.5%(64/982)。64份HBsAg陽性標(biāo)本,其中男性40份,女性24份；男、女獻(xiàn)血員的平均年齡比較無顯著差異(27±6VS.25±8,t=1.247,P=0.217)。64份HBsAg陽性血漿的平均HBsAg定量水平為0.28±0.27 IU/mL (0.05～1.14 IU/mL),其余918份血漿的平均HBsAg定量水平為0.02±0.01 IU/mL(0.00～0.04 IU/mL),兩組間平均HBsAg定量水平的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-14.332,P0.001),而ALT水平的比較則無顯著差異(15.3±5.8VS.14.8±6.3,t=0.598,P=0.550),性別分布也無顯著差異(χ2=0.054,P=0.816). 2.64份HBsAg定量陽性(0.05 IU/mL)血漿經(jīng)敏感的巢式PCR方法擴(kuò)增HBV不同區(qū)段的產(chǎn)物,各區(qū)的總體擴(kuò)增效率分別為：S區(qū)擴(kuò)增陽性19例(29.7%),C區(qū)擴(kuò)增陽性41例(64.1%),X區(qū)擴(kuò)增陽性42例(65.6%)。其中僅一各區(qū)段擴(kuò)增陽性的標(biāo)本分別是：1例S區(qū)陽性(1.6%),7例C區(qū)陽性(10.9%),4例X區(qū)陽性(6.2%)。兩個(gè)區(qū)段以上同時(shí)陽性的標(biāo)本分別是：12例三個(gè)區(qū)段均陽性(18.8%),21例C和X區(qū)同時(shí)陽性(32.8%),1例S和C區(qū)同時(shí)陽性(1.6%),5例S和X區(qū)同時(shí)陽性(7.8%)。此外,擴(kuò)增全陰性標(biāo)本有13例(20.3%)。按照隱匿性HBV感染的PCR診斷要求,只有兩個(gè)或以上區(qū)段擴(kuò)增陽性的標(biāo)本,才能被診斷為隱匿性HBV感染。在本次研究中,我們發(fā)現(xiàn)39名血站合格獻(xiàn)血員可被診斷為隱匿性HBV感染(4.0%,39/982)。 3.經(jīng)序列比對(duì)分析,隱匿性HBV感染者S區(qū)擴(kuò)增陽性的標(biāo)本中并未發(fā)現(xiàn)“a=”決定簇的變異,特別是已有報(bào)道的熱點(diǎn)變異位點(diǎn)。有測序結(jié)果的14份樣品,經(jīng)序列對(duì)比進(jìn)行基因型分析,發(fā)現(xiàn)有6份為B型,其余8例為C型；在6名HBVDNA擴(kuò)增陽性的HBsAg清除者中鑒定出5例為C型,1例為B型,均未發(fā)現(xiàn)“a”決定簇變異,但在2例C型患者中發(fā)現(xiàn)L80I、L180M和M204I三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合變異。 4.在ELISPOT檢測IFN-γ實(shí)驗(yàn)中,HBV特異性T細(xì)胞均可以在HBsAg清除者和隱匿性HBV感染者外周血PBMC中檢測到,陽性反應(yīng)孔的SFC頻數(shù)范圍分別為22～846 SFC/106 PBMC和22～504 SFC/106 PBMC,但兩者的陽性應(yīng)答率無顯著差異(41.1% VS.33.3%,χ2=0.637,P=0.425),而且兩者的陽性反應(yīng)孔的平均SFC頻數(shù)也無顯著差異(113±36 vs.98±31,P=0.976)。HBsAg清除者陽性反應(yīng)孔的平均SFC高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.031)；隱匿性HBV感染者陽性反應(yīng)孔的平均SFC高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.040)。此外,在HBsAg清除者組,rHBcAg比C多肽庫誘導(dǎo)的HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答更強(qiáng)烈(P=0.012),但在隱匿性HBV感染者組,則兩種刺激物誘導(dǎo)的HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度無顯著差異(P=0.302)。rHBcAg誘導(dǎo)的HBsAg清除者總體HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)于隱匿性HBV感染者(P=0.010),與非活動(dòng)性HBsAg攜帶者相當(dāng)(P=-0.549),但強(qiáng)于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.004)。血清陽性(anti-HBc陽性)隱匿性HBV感染者PBMC對(duì)S多肽庫、rHBsAg和rHBcAg呈低反應(yīng)性,但對(duì)C多肽庫的反應(yīng)性則較高(3/4)；血清陰性(anti-HBc陰性)隱匿性HBV感染者PBMC對(duì)S多肽庫、C多肽庫和rHBcAg的反應(yīng)性均較高(均為3/5),但應(yīng)答強(qiáng)度較離散,而對(duì)rHBsAg的反應(yīng)性則為2/5,且應(yīng)答強(qiáng)度較低。 5.總的來說,HBsAg清除者和隱匿性HBV感染者的外周血T細(xì)胞中可檢測到特異性分泌IFN-γ的CD8+和CD4+T細(xì)胞。HBsAg清除者與隱匿性HBV感染者的外周血IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)無顯著差異(P=0.103),但兩者的IFN-γ+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)有顯著差異(P=0.047)。隱匿性HBV感染者IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.011)。HBsAg清除者的IFN-γ+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)高于免疫耐受HBV攜帶者(P=0.023)。4個(gè)研究組的HBV特異性CD8+T細(xì)胞陽性應(yīng)答強(qiáng)度的整體比較有顯著差異(χ2=9.132,P=-0.024),而對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性也不同。HBsAg清除者體外IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)體現(xiàn)出了對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性不同：C多肽庫的陽性反應(yīng)率為78.6%(11/14,IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)范圍：0.06%～0.24%,Median:0.10%),而S多肽庫的陽性反應(yīng)率為21.4%(3/14,IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)：0.08%、0.13%和0.24%)。隱匿性HBV感染者體外IFN-+CD8+T頻數(shù)則未發(fā)現(xiàn)對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性不同：C多肽庫的陽性反應(yīng)率為42.8%(3/7,IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)范圍：0.08%～0.22%,Median:0.11%),S多肽庫的陽性反應(yīng)率為28.6%(2/7,IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)：0.27%和0.38%)。免疫耐受HBV攜帶者CD8+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫和C多肽庫的反應(yīng)率分別為3/7(IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)范圍：0.06%～0.08%,Median:0.06%)和2/7(IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)：0.06%和0.07%);非活動(dòng)性HBsAg攜帶者CD8+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫和C多肽庫的反應(yīng)率分別為4/9(IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)范圍：0.08%～0.32%,Median:0.135%)和6/9(IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)范圍：0.06%～0.23%,Median:0.085%).4個(gè)研究組的HBV特異性CD4+T細(xì)胞陽性應(yīng)答強(qiáng)度的整體比較有顯著差異(χ2=8.628, P=0.035),而對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性也不同。4個(gè)研究組對(duì)S多肽庫的HBV特異性CD4+T細(xì)胞總體應(yīng)答(全部應(yīng)答)進(jìn)行整體比較并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.241,P=0.237),但對(duì)C多肽庫的總體應(yīng)答的整體比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=12.881,P=0.005)。HBsAg清除者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性不同：C多肽庫的陽性反應(yīng)率為11/14,S多肽庫的陽性反應(yīng)率為4/14；盡管HBsAg清除者CD4+T細(xì)胞對(duì)兩種刺激物的陽性應(yīng)答強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-0.987,P=0.324),但是在總體應(yīng)答強(qiáng)度上卻有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-2.151,P=0.031)。隱匿性HBV感染者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性和應(yīng)答強(qiáng)度均較低,分別為2/7(IFN-γ+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)：0.06%和0.07%)和3/7(IFN-γ+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)：0.06%、0.07%和0.10%)；兩種刺激物誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞總體應(yīng)答強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-0.355,P=0.723),而陽性應(yīng)答強(qiáng)度也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-0.609,P=0.543)。免疫耐受HBV攜帶者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)C多肽庫的刺激幾無應(yīng)答(0/7),因此無法用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與隱匿性HBV感染者及HBsAg清除者進(jìn)行比較；而對(duì)S多肽的反應(yīng)性相對(duì)較好(3/7),但應(yīng)答強(qiáng)度也是偏低(0.06%、0.06%和0.07%)。HBsAg清除者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)C多肽庫的總體應(yīng)答強(qiáng)度高于隱匿性HBV感染者和免疫耐受HBV攜帶者(Z=-2.254, P=0.024;Z=-3.257,P=0.001),與非活動(dòng)性HBsAg攜帶者相當(dāng)(Z=-0.823, P=0.411)；但隱匿性HBV感染者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)C多肽庫的總體應(yīng)答強(qiáng)度卻與免疫耐受HBV攜帶者及非活動(dòng)性HBsAg攜帶者相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-0.067,P=0.947;Z=-1.763,P=0.078)。血清陽性(anti-HBc陽性)隱匿性HBV感染者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的刺激幾無反應(yīng),僅有一人的CD8+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫的刺激有反應(yīng)性。血清陰性(anti-HBc陰性)隱匿性HBV感染者體外CD4+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的刺激均有反應(yīng)(2/4和3/4),而CD8+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的刺激反應(yīng)則不同(1/4和3/4),針對(duì)C多肽庫的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度的比較無顯著差異(Z=-1.528,P=0.127)。 6.我們發(fā)現(xiàn)全部檢測對(duì)象經(jīng)S或C多肽庫刺激后胞內(nèi)檢測IL-2陽性T細(xì)胞應(yīng)答具有非均一性。HBsAg清除者CD8+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性均不高(4/14和2/14)；隱匿性HBV感染者CD8+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫稍有反應(yīng)(2/7),而對(duì)C多肽庫則無反應(yīng)(0/7)；免疫耐受HBV攜帶者CD8+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫的反應(yīng)性較好(4/7),但對(duì)C多肽庫的反應(yīng)性偏低(1/7)；非活動(dòng)性HBsAg攜帶者CD8+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫的反應(yīng)性較低(2/9),對(duì)C多肽庫的反應(yīng)性也較低(3/9)。HBsAg清除者CD4+T細(xì)胞對(duì)S和C多肽庫的反應(yīng)性均偏低(均為1/14)；隱匿性HBV感染者CD4+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫稍有反應(yīng)(1/7),而對(duì)C多肽庫則無反應(yīng)(0/7)；免疫耐受HBV攜帶者CD4+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫的反應(yīng)性較好(3/7),但對(duì)C多肽庫的反應(yīng)性偏低(1/7)；非活動(dòng)性HBsAg攜帶者CD4+T細(xì)胞對(duì)S多肽庫的反應(yīng)性較低(2/9),對(duì)C多肽庫的反應(yīng)性也較低(1/9)。用Kruskal-Wallis H test對(duì)CD8+T和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)各組的IL-2+CD8+T細(xì)胞頻數(shù)的整體比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.269,P=0.041);而各組的IL-2+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)的整體比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.534)。 結(jié)論 HBsAg清除者外周血特異性T細(xì)胞應(yīng)答不是由HBV外膜蛋白誘導(dǎo)的,HBsAg清除可能與HBsAg特異性T細(xì)胞免疫不相關(guān),可能是HBV核心抗原誘導(dǎo)為主；血清陰性(anti-HBc陰性)和陽性(anti-HBc陽性)的隱匿性HBV感染者展示出不同的細(xì)胞免疫應(yīng)答特點(diǎn)。隱匿性HBV感染者與HBsAg清除者的特異性T細(xì)胞應(yīng)答特點(diǎn)有異同處,提示兩者達(dá)到HBsAg陰性的機(jī)制可能不同。從慢性HBV感染的自然史的階段分期結(jié)合細(xì)胞免疫學(xué)應(yīng)答的特點(diǎn)來分析,我們有理由認(rèn)為隱匿性HBV感染可能更多的來自急性乙型肝炎恢復(fù)者,而HBsAg清除的慢乙肝恢復(fù)者可能處于非免疫活動(dòng)期,也可能處于恢復(fù)期,然而,這兩種狀態(tài)都可能因?yàn)闄C(jī)體免疫狀態(tài)的改變或病毒突破而導(dǎo)致HBV感染復(fù)燃,重新回到免疫激活期。尤其是HBsAg清除的慢乙肝恢復(fù)者,其長期的隨訪仍然是必需的,而且,從治療基線起始的臨床抗病毒治療隨訪,不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)的動(dòng)態(tài)分析,可能有助于我們摸索出更合理高效的抗病毒治療方案,同時(shí)也可能獲得一些免疫學(xué)指標(biāo)用于臨床療效的預(yù)測。通過更敏感的HBsAg檢測法聯(lián)合anti-HBc抗體篩查或核酸檢測法(NAT)可以提高隱匿性HBV感染者的檢出率,進(jìn)一步降低輸血和器官移植中發(fā)生隱匿性HBV感染的機(jī)會(huì)。
【圖文】：

乙型肝炎(hePatitisB)患者進(jìn)展為肝臟功能失代償、肝硬化和肝細(xì)hepatocellularcareinoma，Hee)的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于健康人群，每年大概有50萬人因HBv感染引發(fā)的嚴(yán)重肝病死亡川。我國的HBv感染者約為1.中有2000一3000萬為慢性活動(dòng)性肝病患者。全國每年死于與1」BV感染相約30萬人，據(jù)估計(jì)，我國每年因慢性乙型肝炎所帶來的直接經(jīng)濟(jì)損失約為人民幣。不僅如此因?yàn)榇蟊妼?duì)于HBV感染的認(rèn)識(shí)尚存不足，使得HB者本人和家庭都要面對(duì)來自不同方面和不同程度的困難(入托、升學(xué)、嫁、生育等等)。因此，1」BV感染己經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國人民身心健康公的問題。最近幾十年對(duì)HBV病毒學(xué)和免疫學(xué)的理解不斷更新，，同時(shí)也伴敏感性檢測方法的出現(xiàn)，讓我們對(duì)HBV感染自然史有了新的認(rèn)識(shí)。此外98年第一個(gè)口服抗病毒藥物獲準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎后，我們對(duì)乙型以進(jìn)行有效的臨床管理。

前基因組在核心顆粒內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄為松弛環(huán)狀 DNA(relaxedeireularDNA，rcDNA)，一部分核心顆粒重新進(jìn)入細(xì)胞核補(bǔ)充核內(nèi)cccDNA池，其余核心顆粒與LHBs的Presl區(qū)結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)獲得包膜，再出芽分泌至細(xì)胞外(圖1一4)I’j。核心顆粒與LHBs是直接相互作用還是需要其它蛋白的參與目前還不清楚�！�...賺孺知‘海，H“v辛S閱洲目目H吸栩.m‘滋西。。nud“，.......國畫姻四口圖1一4乙型肝炎病毒的生活周期Figurel一 4thelifecycleofhepatitisB、一lrus根據(jù)HBV全基因序列相差全8%或S基因序列差異全4%將HBV分為不同的基因型l5]。到目前為止一共鑒定了8個(gè)HBv基因型，分別為基因型A、B、C、D、E、F、G和H，血清型和基因型的對(duì)照及地理分布見表1一212，“]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在HBV同一基因型內(nèi)也存在著較大差異，并根據(jù)核普酸序列異質(zhì)性全4%
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Eva Billerbeck;Tobias B銉ttler;Robert Thimme;;Regulatory T cells in viral hepatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年36期

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本文編號(hào)：2638102