【摘要】：克羅恩病(Crohn disease,CD)屬于炎性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD),臨床表現(xiàn)為消化道節(jié)段性的炎性損傷,嚴重影響患者的生存質(zhì)量。該病在歐美國家較常見,近年來由于生活方式的改變、環(huán)境的變化及診療水平的提高,我國醫(yī)生在臨床工作中發(fā)現(xiàn)克羅恩病的發(fā)病率有增多的趨勢。由此帶來紛繁復雜的臨床問題,引起專業(yè)醫(yī)生的高度重視�？肆_恩病的病因及發(fā)病機制尚未清楚。目前的研究主要集中在遺傳易感性、免疫調(diào)節(jié)紊亂、感染及環(huán)境因素等環(huán)節(jié)上。在克羅恩病治療方面,由于發(fā)病機制并不完全明了,因此其治療研究進展緩慢,目前常用的藥物治療效果并不理想,且并發(fā)癥較多。因此,深入揭示克羅恩病發(fā)病機理,探尋高效、低毒的治療方法一直是胃腸病學家致力于研究的方向。臨床和動物實驗研究表明,腸黏膜對腸道共生菌的免疫耐受缺失是克羅恩病的主要發(fā)病機制。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)是公認的具有T細胞活化作用和啟動抗原特異性免疫反應的細胞,在克羅恩病的發(fā)病中具有重要作用,是目前已知的功能最強的抗原遞呈細胞,被認為是連接特異性免疫應答和非特異性免疫應答的橋梁,并且可決定機體特異性免疫應答的類型。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是DCs識別腸道微生物病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)而將其區(qū)分的重要工具。腸道DCs可表達多種TLR,而不同的TLR亞型具有不同的外源性配基。目前研究表明,TLR2、TLR4、TLR5和TLR9與腸黏膜穩(wěn)態(tài)和炎性病變有關(guān),且不同的TLR亞型在炎性病變中具有不同的作用。雖然DCs在腸黏膜穩(wěn)態(tài)和免疫耐受缺失中起到重要的作用,有關(guān)TLR在克羅恩病發(fā)病機理中的作用的研究也備受關(guān)注,但基于DCs的TLR信號通路在克羅恩病病理生理中的作用尚不完全清楚。雷公藤多甙具有抗炎和免疫抑制等作用,臨床已廣泛用于類風濕性關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎等多種自身免疫性疾病的治療,療效顯著。我們的臨床研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多甙能夠有效的治療克羅恩病,既可以誘導疾病緩解又可以維持緩解,有些病例應用雷公藤多甙甚至取得意想不到的良好效果。雷公藤甲素(triptolide,TP)是雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物,是雷公藤多甙的主要有效成分之一。我們研究發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素能夠有效的緩解克羅恩病模型小鼠(IL-10基因敲除小鼠)的腸組織炎癥,小鼠的存活率和生存狀態(tài)顯著改善。這一作用可能與其能夠抑制多種Thl型細胞因子的表達有關(guān)。提示雷公藤甲素具有顯著的抗炎和免疫抑制作用,對于CD的治療具有潛在的優(yōu)勢,但是確切的機制尚未完全明了。本課題以IL-10--小鼠和克羅恩病患者腸標本為研究對象,通過在體實驗和離體實驗探討DCs的TLR信號通路變化在克羅恩病病理生理中的作用和雷公藤甲素的影響,從而為闡釋克羅恩病的病理生理、為臨床應用雷公藤多甙治療克羅恩病奠定理論基礎,從而為發(fā)病率日益增加的克羅恩病提供一種經(jīng)濟有效的治療方法。第一部分在體研究腸道組織TLR信號通路在克羅恩病模型中的表達和雷公藤甲素的影響目的:將IL-I0-/-小鼠作為克羅恩病模型,觀察其相對與野生型小鼠TLR信號通路的變化,以及雷公藤甲素對模型小鼠的TLR信號通路的影響。材料和方法:建立IL-10-/-小鼠慢性腸炎模型。5-6周齡雄性IL-10-/-小鼠,隨機分為兩組。Triptolide組:IL-10-/-小鼠隔日腹腔注射雷公藤甲素(0.07 mg/kg);Control組:IL-10-/-小鼠隔日腹腔等量注射生理鹽水。部分實驗加取同背景同齡野生型小鼠做對照。Control組和Triptolide組隔日給藥,連續(xù)給藥8周。觀察小鼠結(jié)腸組織病理學變化,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)結(jié)腸組織MPO的改變,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)腸組織TLR2和TLR4的變化,實時定量聚合酶鏈反應實驗(RT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)法測定TLR2、TLR4的基因和蛋白表達變化以及下游分子MyD88的變化。結(jié)果:雷公藤甲素可以顯著減輕結(jié)腸慢性炎癥,降低組織病理學評分,減少結(jié)腸MPO的表達,TLR2和TLR4在IL-10-/-小鼠結(jié)腸組織表達高于野生型小鼠,雷公藤甲素可以抑制IL-10-/-小鼠TLR2和TLR4在結(jié)腸的表達,并且抑制其下游分子MyD88的表達。結(jié)論:TLR信號通路在IL-10-/-小鼠結(jié)腸組織中被激活,雷公藤甲素能夠通過調(diào)節(jié)IL-10-/-小鼠的TLR信號通路,抑制腸道炎癥。第二部分在體研究腸道組織樹突狀細胞TLR信號通路在克羅恩病模型中的表達和雷公藤甲素的影響目的:分離提取IL-10-/-小鼠結(jié)腸樹突狀細胞,觀察雷公藤甲素對IL-10-/-小鼠結(jié)腸樹突狀細胞TLR信號通路的影響。材料和方法:5-6周齡雄性IL-10-/-小鼠,隨機分為兩組。Triptolide組:IL-10-/-小鼠隔日腹腔注射雷公藤甲素(0.07 mg/kg);Control組:IL-10-/-小鼠隔日腹腔等量注射生理鹽水,連續(xù)給藥8周。采用磁式細胞分選法分離提取小鼠結(jié)腸樹突狀細胞,檢測純度和存活率后,提取細胞總RNA,行Real time PCR檢測樹突狀細胞的TLR2、TLR4、MyD88的基因表達,提取細胞的總蛋白及核蛋白,免疫印跡(Western Blot)法測定TLR2、TLR4的蛋白表達以及核蛋白中NFkB表達的變化。結(jié)果:流式細胞儀檢測分選出的樹突狀細胞(CD11c標記)純度在90%以上,臺盼藍染色鑒定細胞存活率為90%以上。雷公藤甲素可以顯著抑制結(jié)腸樹突狀細胞TLR2和TLR4的基因和蛋白水平表達,并且抑制下游分子MyD88的mRNA基因表達以及核蛋白中NFkB的表達。結(jié)論:采用磁式細胞分選方法分離提取腸樹突狀細胞,簡便易行,分離的純度和存活率高,方法可靠。雷公藤甲素能夠抑制樹突狀細胞TLR信號通路,樹突狀細胞是雷公藤甲素的作用的重要靶細胞。第三部分離體研究樹突狀細胞TLR信號通路在克羅恩病中的表達和雷公藤甲素的影響目的:取術(shù)中切除結(jié)腸型克羅恩病患者病變結(jié)腸標本并提取樹突狀細胞,觀察和分析TLR2、TLR4及NFkB的基因和蛋白水平表達,并觀察雷公藤甲素干預后的變化,探討雷公藤甲素對克羅恩病患者結(jié)腸組織和樹突狀細胞TLR信號通路的影響。材料和方法:取術(shù)中切除結(jié)腸型克羅恩病患者病變結(jié)腸標本,隨機分為Control 組和 Triptolide 組。將組織放入含 125ug/ml 的 Zymosan 和 50 μ g/ml Lipoteichoicacid(LTA)(TLR2 配體)及 10 ug/ml lipopolysaccharide(LPS,TLR4配體)的CMRL-1066組織培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時,Triptolide組加入20ng/ml的雷公藤甲素。提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后行realtimePCR檢測樹突狀細胞的TLR2、TLR4的基因表達。磁式細胞分選法分離純化結(jié)腸組織樹突狀細胞,隨機分為Control組和Triptolide組。放入含上述TLR配體的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時,Triptolide組加入20 ng/ml的雷公藤甲素。取各組細胞孵育24小時后的培養(yǎng)基上清,ELISA檢測培養(yǎng)基上清中TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-5的水平。流式細胞儀測細胞表面共刺激分子MHCⅡ、CD86的表達,提取細胞的RNA及蛋白,real time PCR及免疫印跡(Western Blot)法測定TLR2、TLR4、MyD88 及 NFkB 的表達。結(jié)果:雷公藤甲素可以抑制克羅恩病患者結(jié)腸組織TLR2和TLR4的表達;雷公藤甲素可抑制細胞培養(yǎng)上清中細胞因子TNF-α、INF-γ的水平,對IL-4、IL-5的水平無明顯影響;雷公藤甲素可抑制樹突狀細胞表面共刺激分子MHCⅡ、CD86的表達,雷公藤甲素可以抑制樹突狀細胞TLR2、TLR4以及下游分子MyD88和NFkB的表達。結(jié)論:雷公藤甲素體外夠降低Th1型細胞因子的表達,對Th2型細胞因子無明顯作用,克羅恩病是以Th1型細胞因子占主導地位的炎癥反應,進一步奠定雷公藤甲素治療克羅恩病的理論基礎;雷公藤甲素可抑制DCs表面的共刺激分子的表達,即能夠改變DCs的成熟狀態(tài),從而誘導免疫耐受;雷公藤甲素對于克羅恩病患者的結(jié)腸組織和細胞水平均能夠抑制TLR/NFkB信號通路,對其用于CD病人進一步提供了理論基礎。總結(jié)一、雷公藤甲素對于克羅恩病模型小鼠具有良好的治療效果,TLR信號通路在克羅恩病模型小鼠發(fā)病中具有重要作用,雷公藤甲素可以通過作用TLR信號通路調(diào)節(jié)異常的腸粘膜免疫,抑制炎癥反應。二、雷公藤甲素不僅對于克羅恩病模型小鼠的TLR信號通路有干預作用,還可以作用于克羅恩病患者病變腸道組織和樹突狀細胞的TLR信號通路,為臨床治療克羅恩病提供了理論基礎。三、體內(nèi)體外研究均表明樹突狀細胞是雷公藤甲素作用的重要靶細胞,推測靶向干預樹突狀細胞的TLR信號通路可能為治療克羅恩病提供新的策略,這有待進一步證實。
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R574.62

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本文編號：2636163