【摘要】：研究背景及目的 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因尚不明了的慢性腸道炎癥,包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's disease, CD)。 IBD病程遷延,顯著影響患者生活質量,又有癌變威脅及發(fā)生出血、穿孔、梗阻和瘺管形成等嚴重并發(fā)癥的可能性。目前無論藥物或手術治療后,疾病均易復發(fā),尚無根治的方法。因此闡明其病發(fā)病機制,為臨床診療提供新思路及理論支持仍是我們面臨的重要任務和挑戰(zhàn)之一。目前,隨著免疫學、分子生物學等學科的迅速發(fā)展,以及動物模型研究的日趨成熟,其病因的探索已經(jīng)取得了長足的進步,一幅內(nèi)皮細胞,腦-腸肽/激素,免疫及腸道黏膜內(nèi)的炎癥細胞之間相互作用造成黏膜炎癥的圖片已經(jīng)漸漸呈現(xiàn)在我們面前。 近年來,多個實驗室應用急性或慢性腸炎動物模型研究結果表明,血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、 P物質(substance P,SP)、神經(jīng)肽Y (neuropeptide Y, NPY)、(?)申經(jīng)降壓素(neurotensin.NT)等與其在腸道黏膜相應受體之間的抗原抗體反應可促進腸道黏膜炎癥的發(fā)生。盡管腦-腸肽/激素與IBD的關系還需要進一步探討,目前的研究已提供了有益啟示,通過對腦-腸肽/激素研究可加深我們對炎癥性腸病的認識,并為其治療開辟嶄新的領域。 神經(jīng)介素U (neuromedin U, NMU)于80年代首次從豬脊髓中發(fā)現(xiàn)并分離提純,因其對大鼠子宮(uterus)平滑肌產(chǎn)生強烈收縮作用,故以U命名。隨著對NMU研究的深入,目前發(fā)現(xiàn)NMU是一種在胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)廣泛分布的小分子多肽,不同物種的NMU在長期進化壓力下仍具有高度的保守結構,表明NMU具有重要的生理功能。NMU通過與其受體結合發(fā)揮作用。NMU的兩個特異性的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)受體1(neuromedin U receptors1.NMUR1)和受體2(neuromedin U redceptor2,NMUR2)(又名FM3和FM4)廣泛分布在動物體內(nèi),并具有不同的分布模式,從而使NMU顯示出多樣性的生理病理功能。NMUR1主要分布在胃腸道及泌尿系統(tǒng),而NMUR2主要局限在中樞神經(jīng)系統(tǒng)�，F(xiàn)已證實NMU在調(diào)節(jié)平滑肌收縮、血壓與局部血流、腸胃離子轉運、能量代謝、攝食行為、胃酸分泌與胃排空、痛覺、癌癥等方面具有重要的作用。研究表明,NMU及其受體1均在胃腸道中高表達,其在胃腸道正常的生理功能主要通過激活Gq/11蛋白調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流,誘導腸道平滑肌收縮及蠕動。實驗證明,在野生型小鼠及NMUR2敲除小鼠中,NMU誘導的胃腸道平滑肌收縮及蠕動,并未受到影響,另外因NMUR2受體主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達,提示我們NMU/NMUR1軸而非NMU/NMUR2軸在胃腸道的正常生理功能中發(fā)揮主要的調(diào)節(jié)作用。隨著對NMU受體的深入研究,發(fā)現(xiàn)NMUR1而不是NMUR2分布在肺、脾臟及淋巴細胞等免疫器官及細胞,從而提示NMU/NMUR1軸在免疫調(diào)節(jié)中也扮演了重要的角色。目前,神經(jīng)介素U在炎癥性疾病中的作用已經(jīng)在多個疾病模型得到證實,包括皮膚炎癥、感染性休克、哮喘及關節(jié)炎的NMU缺陷小鼠模型。 但是,目前關于NMU參與炎癥性疾病的具體機制仍不清楚,國際上尚未見NMU與IBD相關聯(lián)系的報道。因此,為了進一步探討IBD的發(fā)病機制為將來的治療提供更多的理論證據(jù)與支持,我們課題組將首次探討了NMU及其受體1-NMUR1在IBD中所扮演的角色。本課題分二部分進行,第一部分：我們首先檢測NMU及NMUR1在IBD患者及5%硫酸葡聚糖(Dextran sulfate sodium, DSS)誘導急性小鼠結腸炎模型病變結腸表達情況,初步明確NMU/NMUR1軸是否參與IBD發(fā)��；然后經(jīng)腹腔注射MMU中和抗體干預5%DSS誘導的急性小鼠結腸炎模型,觀察實驗鼠的臨床癥狀、組織學損傷情況,腸道粘膜與腹腔巨噬細胞中炎癥細胞因子表達情況,從而探討NMU/NMUR1軸在IBD發(fā)病中的作用及可能機制。第二部分：構建NMUR1受體高表達的人結腸上皮細胞模型,應用人NMU核心肽干預該細胞,然后應用一系列分子生物學方法,初步探索NMU/NMUR1軸誘導炎癥細胞因子IL-8表達、分泌所涉及的信號通路。 第一部分神經(jīng)介素U及其受體1在IBD患者及動物模型的表達及作用機制的初步研究 [目的] 1.檢測NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及DSS誘導急性結腸炎小鼠模型病變結腸段表達情況。 2.應用NMU中和抗體干預急性小鼠結腸炎模型,研究NMU在腸道炎癥中的作用及可能機制。 [方法] 1.定量Real-time PCR檢測NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及正常對照的結腸組織表達情況。 2.急性結腸炎小鼠模型的建立及標本的采集：FVB小鼠根據(jù)實驗目的分為兩大組：第一大組：FVB小鼠25只,隨機分為5組,自由飲用5%DSS溶液8天。分別在第0,3,5,7,8天5個時間點處死小鼠,留取病變結腸段檢測NMU及NMUR1mRNA表達情況。第二大組：52只FVB小鼠,隨機分為4組,具體分組及干預如下：比較各組小鼠的疾病活動情況(DAI)評分、組織損傷評分、結腸重量／長度以及、髓過氧化物酶(MPO)活性等炎癥參數(shù)。另外,用Real-time PCR(?)法檢測小鼠結腸段及腹腔巨噬細胞炎癥細胞因子TNF-α,IL-8,IL-1p,IL-6表達情況。 [結果] 1.NMU及NMUR1mRNA在UC及CD患者及5%DSS誘導急性結腸炎小鼠模型病變結腸段表達水平均顯著升高。 2.NMU中和抗體對DSS誘導急性結腸炎癥有保護作用。 飲用普通水的對照組小鼠體重均有不同程度增加,無小鼠死亡,結腸無明顯縮短,MPO幾乎測不到。5%DSS造模組體重均有不同程度下降,但IgG組下降程度顯著高于anti-NMU組;anti-NMU組小鼠死亡率顯著低于IgG組(15%vs0%,P0.05)：anti-NMU組小鼠平均結腸重量與長度的比值顯著低于IgG組(0.038g/cm vs0.049g/cm, P0.01); anti-NMU組DAI評分顯著低于IgG組；DSS致炎第8天,IgG組小鼠結腸黏膜充血水腫、潰瘍形成,腺體不完整或消失,結腸隱窩完全或部分缺失且黏膜固有層炎癥細胞浸潤明顯,而anti-NMU組黏膜水腫少見,無潰瘍,腺體排列整齊,僅見少量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤；組織學損傷評分示,anti-NMU組評分顯著低于IgG組(1.2vs3.1,P0.05)；5%DSS造模組小鼠炎癥結腸段MPO均有不同程度升高,但anti-NMU組顯著低于對照IgG組(60vs115,P0.05)。 3. NMU中和抗體降低急性結腸炎小鼠病變結腸段炎癥細胞因子表達水平 與IgG組相比,anti-NMU組小鼠病變結腸段1L-8及IL-6mRNA表達顯著下(P0.01); TNF-α. IL-1βmRNA表達水平亦顯著降低(P0.05)。 4. NMU中和抗體降低急性結腸炎小鼠腹腔巨噬細胞炎癥細胞因子表達水平 與IgG組相比,anti-NMU組小鼠腹腔巨噬細胞的IL-8及IL-6mRNA表達水平顯著降低(P0.01)；TNFa及IL-1βmRNA表達水平亦有下降(P0.05)。 [結論] 1.NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及DSS誘導急性小鼠結腸炎模型病變結腸段顯著升高。 2.NMU中和抗體對DSS誘導急性結腸炎小鼠模型有保護作用,提示NMU是IBD發(fā)病重要的調(diào)節(jié)介質。其機制可能與促進炎性細胞因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表達分泌有關。 第二部分神經(jīng)介素U通過激活NF-KB及AP-1信號通路調(diào)節(jié)IL-8表達與分泌 [目的]研究神經(jīng)介素U的高親和G蛋白偶聯(lián)受體1(NMUR1)活化后調(diào)節(jié)IL-8表達與分泌所涉及的信號通路 [方法] 1.在人正常結腸上皮細胞NCM460基礎上構建NMUR1穩(wěn)定高表達細胞株-NCM460-NMUR1。 2.根據(jù)實驗目的,應用人NMU核心肽、信號通路藥物抑制劑及不同質粒DNA干預NCM460-NMUR1細胞,然后應用：(1) ELISA法檢測細胞上清液IL-8濃度。(2)雙熒光素酶法檢測IL-8啟動子活性。(3) Western Blot檢測目的蛋白表達。(3)定量Real-time PCR檢測細胞c-jun和c-fos mRNA表達水平。(4) ChIP分析：分析p65蛋白與IL-8啟動子區(qū)κB結合位點結合能力。 [結果] 1. NMU刺激NCM460-NMUR1細胞IL-8轉錄與分泌 成功構建NMUR1受體高表達細胞株NCM460-NMUR1,然后應用NMU干預陔細胞,收集上清檢測IL-8濃度。結果示,NMU可顯著誘導NCM460-NMUR1細胞分泌IL-8并呈濃度、時間依賴；雙熒光素酶結果示,NMU顯著增強IL-8啟動子活性,增強IL-8基因轉錄。 2. NMU激活經(jīng)典NF-κB信號通路 Western blot結果示,NMU刺激NCM460-NMUR1細胞15分鐘即可引起細胞總IκBα蛋白降低,p-IκBα蛋白增高,細胞核p65蛋白增加,30-60分鐘達到最高水平。ChIP示NMU刺激15分鐘后,NCM460-NMUR1細胞核p65蛋白便開始與IL-8啟動子區(qū)KB位點結合,結合活性逐漸增強,30-60分鐘達最高。 3.阻斷NF-KB信號通路抑制NMU誘導的IL-8基因轉錄與分泌 IL-8啟動子區(qū)KB結合位點變異及IκBα表達質�？娠@著降低NMU誘導IL-8轉錄活性增高；NF-κB信號通路抑制劑咖啡酸苯乙酯(CAPE)顯著降低NMU誘導IL-8分泌。 3.NMU誘導核轉錄因子AP-1亞單位c-un及c-fos表達活化 Real-time PCR(?)吉果示,與對照組相比,NMU刺激NCM460-NMUR1細胞半小時,其c-jun及c-fos mRNA表達水平便顯著升高,在1小時達到最高水平后開始下降。Western blot結果與real-time PCR(?)吉果相符,NMU刺激NCM460-NMUR1細胞1小時c-Jun蛋白表達開始升高,2小時c-Jun達最最高水平。 4.AP-1信號通路調(diào)節(jié)IL-8表達 應用IL-8啟動子區(qū)AP-1結合位點變異、c-Jun siRNA干擾c-Jun表達及A-Fos質粒三種分子生物學方法阻斷AP-1通路可顯著降低NMU誘導的IL-8轉錄活性增強,提示AP-1信號通路參與調(diào)節(jié)IL-8基因轉錄。 6.NMU激活MAPKs信號通路介導AP-I活化 Western blot結果示,NMU可活化p-ERK1/2, p38及p-JNK蛋白,其中p-JNK與p-p38在NMU刺激30分鐘時達高峰,而p-ERK1/2在刺激15分鐘時表達便達到最高水平；MAPKs特異性抑制劑PD98059(ERK抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)均可顯著抑制NMU誘導NCM460-NMUR1細胞c-jun及c-fos mRNA表達,其中SB203580作用更明顯。3種抑制劑聯(lián)合應用有協(xié)同效應幾乎完全阻斷c-jun及c-fos mRNA表達。該研究結果提示MAPK信號通路是AP-1的上游信號分子。 [結論] 在NMUR1高表達的結腸上皮細胞,NMU與NMUR1結合后可激活重要炎癥信號通路--經(jīng)典NF-κB及AP-1信號通路,活化核轉錄因子NF-κB及AP-1與IL-8啟動子區(qū)KB及AP-1位點結合調(diào)節(jié)細胞因子IL-8基因表達、分泌。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R574

【參考文獻】

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1 甘華田,歐陽欽,陳友琴,夏慶杰;潰瘍性結腸炎患者腸粘膜κ基因結合核因子的活化及抗炎藥物的作用[J];中華醫(yī)學雜志;2002年06期

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本文編號：2633789