【摘要】：第一部分酪酸梭菌調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對實驗性結(jié)腸炎的影響目的:從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化角度,探討不同濃度酪酸梭菌活菌對小鼠硫酸葡聚糖(dextran sodium sulfate,DSS)實驗性結(jié)腸炎的影響。材料與方法:50只雄性C57B/6小鼠隨機分為5組,每組10只,即1)正常對照組2)DSS模型組3)低劑量酪酸梭菌活菌處理組4)中劑量酪酸梭菌活菌處理組5)高劑量酪酸梭菌活菌處理組。除正常對照組小鼠外,其余小鼠每日自由飲用3.5%DSS溶液,共7天,建立DSS結(jié)腸炎小鼠模型;在結(jié)腸炎造模開始前7天,除正常對照組、模型組小鼠外,其余小鼠分別給予107CFU/ml、108CFU/ml、109CFU/ml酪酸梭菌活菌0.2ml灌胃,以建立低劑量、中劑量、高劑量酪酸梭菌活菌干預(yù)模型,并從以下兩個方面進(jìn)行評估(1)小鼠結(jié)腸炎癥程度:結(jié)腸炎造模開始后,每日記錄各組小鼠疾病活動指數(shù);造模結(jié)束后,測量小鼠結(jié)腸長度,計算結(jié)腸組織炎癥損傷評分,ELISA法檢測血清TNF-α含量。(2)小鼠結(jié)腸組織上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化:qRT-PCR法檢測各組小鼠結(jié)腸組織中E-cadherin mRNA、Vimentin mRNA表達(dá)量;免疫組化方法半定量測定結(jié)腸組織中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,定量資料用means ± standard deviation(SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:自由飲用3.5%DSS溶液7天能成功建立DSS結(jié)腸炎小鼠模型。除1只高劑量酪酸梭菌活菌處理組小鼠和1只中劑量酪酸梭菌活菌處理組小鼠在實驗過程中意外死亡外,其余組小鼠均正常存活至實驗結(jié)束。(一)小鼠結(jié)腸炎癥程度評估結(jié)果:(1)在疾病活動指數(shù)方面,與DSS結(jié)腸炎模型組相比,高劑量酪酸梭菌活菌處理組小鼠僅在早期(實驗第11天)顯著降低了疾病活動指數(shù),而低劑量、中劑量酪酸梭菌活菌在后期(實驗第13天)開始顯著降低疾病活動指數(shù),P0.05;(2)在結(jié)腸大體形態(tài)及結(jié)腸長度方面,與DSS結(jié)腸炎模型組相比,低劑量、中劑量酪酸梭菌活菌可顯著減輕結(jié)腸黏膜水腫程度及結(jié)腸短縮程度,P0.05;(3)在組織學(xué)損傷評分方面,與DSS結(jié)腸炎模型組相比,低劑量、中劑量酪酸梭菌活菌可顯著降低組織學(xué)損傷評分,P0.05;(4)在血清炎性因子方面,與DSS結(jié)腸炎模型組相比,三個酪酸梭菌活菌處理組均抑制了結(jié)腸炎小鼠血清TNF-α表達(dá),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。(二)小鼠結(jié)腸組織上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化評估結(jié)果:(1)在蛋白水平上,免疫組化顯示,三個酪酸梭菌活菌處理組均可上調(diào)結(jié)腸組織上皮表型E-cadherin的表達(dá),但與DSS結(jié)腸炎模型組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;而中劑量、高劑量酪酸梭菌活菌處理組可顯著下調(diào)間質(zhì)表型Vimentin表達(dá),P0.05。(2)在mRNA水平,qRT-PCR顯示,三個酪酸梭菌活菌處理組均可上調(diào)結(jié)腸上皮E-cadherin mRNA表達(dá)量,但與DSS結(jié)腸炎模型組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;而中劑量酪酸梭菌活菌處理組可顯著下調(diào)結(jié)腸間質(zhì)Vimentin mRNA表達(dá)量,P0.05。結(jié)論:1、從疾病活動指數(shù)、結(jié)腸短縮程度、結(jié)腸大體觀及鏡下組織損傷評分、血清TNF-α水平方面,不同劑量酪酸梭菌活菌能夠減輕小鼠DSS結(jié)腸炎的炎癥程度,最佳活菌劑量為108CFU/ml;2、在mRNA和蛋白水平,不同濃度酪酸梭菌活菌能夠抑制DSS結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為上調(diào)腸上皮表型表達(dá)、下調(diào)間質(zhì)表型表達(dá),這種作用以中劑量活菌(108CFU/ml)效果最顯著。第二部分酪酸梭菌有效成分對腸上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞活性的作用分析目的:探討兩種不同濃度酪酸梭菌上清液和滅活菌對腸上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其細(xì)胞活性的作用分析。材料與方法:培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞系作為空白對照組,用10ng/ml人重組TGF-β1刺激IEC-6細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,分別用低濃度(106CFU/ml)和高濃度(107CFU/ml)酪酸梭菌上清液及熱滅活菌與TGF-β1刺激的IEC-6細(xì)胞共培養(yǎng)4天。在實驗第2天(Day2)和實驗第4天(Day4),從以下兩方面評估(1)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(主要是細(xì)胞極性);(2)CCK-8法測定細(xì)胞活性。實驗結(jié)束時,從mRNA水平和蛋白水平上評估菌液上清和滅活菌對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,即(1)qRT-PCR測定細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β11mRNA表達(dá)量;(2)Western blotting法測定細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量。最后,所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,以P值0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:實驗第2天(Day2),CCK-8檢測顯示,高濃度熱滅活酪酸梭菌處理組細(xì)胞與其他組細(xì)胞相比,細(xì)胞活性顯著提高(P0.05),其余組之間的細(xì)胞活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);在實驗第4天(Day4),與空白對照組細(xì)胞相比,TGF-β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)樣變IEC-6細(xì)胞活性下降,而高濃度酪酸梭菌上清液和熱滅活菌處理后,可提高上皮-間質(zhì)樣變IEC-6的細(xì)胞活性,其中,高濃度酪酸梭菌上清液處理組的細(xì)胞活性有統(tǒng)計學(xué)增高(P0.05)。在腸上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面:(1)倒置顯微鏡觀察,TGF-β1與IEC-6細(xì)胞共培養(yǎng)第2天(Day2),細(xì)胞極性及緊密連接已受破壞,應(yīng)用高濃度酪酸梭菌上清液及滅活菌處理后,能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的極性和緊密連接破壞;實驗第4天(Day4),兩種濃度的酪酸梭菌上清液及滅活菌均可抑制上皮-間質(zhì)樣變IEC-6細(xì)胞間緊密連接及細(xì)胞極性的破壞。(2)實驗結(jié)束提取細(xì)胞mRNA,qRT-PCR檢測顯示,與TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)樣變的IEC-6細(xì)胞相比,兩種濃度的酪酸梭菌上清液及熱滅活菌均能顯著下調(diào)細(xì)胞Vimentin mRNA表達(dá)量(P0.05);高濃度酪酸梭菌上清液上調(diào)細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)最明顯,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);菌液上清和滅活菌也均可下調(diào)細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)量(P0.05)。(3)實驗結(jié)束提取細(xì)胞蛋白,Western blotting法測定,與間質(zhì)樣變的IEC-6細(xì)胞相比,高濃度酪酸梭菌上清液可上調(diào)細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)及顯著下調(diào)細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)。結(jié)論:酪酸梭菌上清液及滅活菌可抑制IEC-6發(fā)生TGF-β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并提高間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞活性,以107CFU/ml酪酸梭菌上清液效果最佳。這可能與菌液上清中富含的大量短鏈脂肪酸有關(guān)。
【圖文】：

圖２各組小鼠不同時間段ＤＡＩ評分圖。Ａ圖，Ｄａｙｌｌ各組小鼠ＤＡＩ評分；Ｂ圖，Ｄａｙｌ２逡逑各組小鼠ＤＡＩ評分；Ｃ圖，Ｄａｙｌ３各組小鼠ＤＡＩ評分；Ｄ圖，Ｄａｙｌ４各組小鼠ＤＡＩ評分。逡逑＊代表正常組與ＤＳＳ結(jié)腸炎模型組間比較，＃代表ＤＳＳ結(jié)腸炎模型組與酪酸梭菌活逡逑菌處理組間比較，尸＜０．０５逡逑３０逡逑

圖３各組小鼠結(jié)腸組織大體觀及結(jié)腸長度測量。Ａ圖，正常對照組；Ｂ圖，ＤＳＳ結(jié)腸炎模逡逑型組；Ｃ圖，低劑量酪酸梭菌活菌處理組；Ｄ閹，中劑量酪酸梭菌活菌處理組；Ｅ圖，，尚劑逡逑丨ｆｔ酩酸梭菌活Ｍ處理組逡逑森邐．．邋．邋．＊邐＼邋＾邐＇邐，邋％．－邋－邋＇逡逑Ａ邋、邐－邐＾邐－Ｃ．邐．逡逑ｊｍ邋ｓ：－．，：；；？■－邐．逡逑ｘ邋＾邋－／Ｖ，ｒ．＾：－＇．逡逑卜．s{邐ｖｊ逡逑．務(wù)、’？？．’？邐一邋－邋Ｅ邋＊？邋３邐＇邐——逡逑Ｖ邋．ｉ．．：：丨邋Ｔ邋．ｉ邋毛逡逑？■逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R574.62

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本文編號：2629645