【摘要】： HBV(Hepatitis B virus)感染是肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)高發(fā)的最主要原因。研究HBV致病機(jī)制的重要途徑就是建立方便有效的HBV感染模型。我們前期的研究建立了能使HBV長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)抗原并復(fù)制的HBV HepG2肝癌細(xì)胞株RHBV-3,同時(shí)獲得了空載體細(xì)胞株RepSal-1。RepSal-1、REP-HBV細(xì)胞株的成功建立為我們研究HBV復(fù)制在整體水平對(duì)細(xì)胞的影響提供了途徑。 細(xì)胞原癌基因(proto-oncogene)與細(xì)胞正常功能有關(guān),當(dāng)發(fā)生突變或異�；罨瘯r(shí)可引起腫瘤發(fā)生。目前的研究認(rèn)為HBV可能通過(guò)DNA整合激活原癌基因(順式活化作用)或其編碼的病毒產(chǎn)物反式活化細(xì)胞基因發(fā)揮致癌作用。 另外,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在整合有HBV DNA的Hep3B細(xì)胞及感染HBV的肝癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)增高,而對(duì)TIMPs的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此本研究擬通過(guò)對(duì)RepSal-1、RHBV-3細(xì)胞株中原癌基因、MMPs及TIMPs基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及酶活性的分析,初步了解HBV在整體水平上對(duì)癌相關(guān)基因的影響,進(jìn)而探討HBV致肝癌的機(jī)制及其與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 本研究第一部分通過(guò)設(shè)計(jì)基因特異性引物,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timeQuantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR)初步分析HBV對(duì)HepG2細(xì)胞原癌基因Ras、Jun、Myc、Fos及MMP2、9和TIMP1-4基因轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)果表明HBV復(fù)制促進(jìn)Ras、Jun、Myc、MMP2、9、TIMP1、3基因轉(zhuǎn)錄,抑制TIMP4基因轉(zhuǎn)錄。對(duì)TIMP2無(wú)影響。 本研究第二部分通過(guò)明膠酶譜檢測(cè)MMP2、9酶活性。結(jié)果顯示,HBV能增強(qiáng)MMP2、MMP9的表達(dá)和激活。反相明膠酶譜法檢測(cè)結(jié)果顯示,HBV增強(qiáng)細(xì)胞中TIMP1、TIMP3表達(dá),抑制TIMP4表達(dá)。 總之,本研究結(jié)果表明HBV可影響原癌基因、MMPs、TIMPs的基因轉(zhuǎn)錄,這與HBV相關(guān)的HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
【圖文】：

法進(jìn)行計(jì)算:待側(cè)基因△Ct=平均待測(cè)基因△Ct‘平均GC拼待測(cè)基因△Ct實(shí)驗(yàn)組一待測(cè)基因△Ct對(duì)照組，，對(duì)照組和數(shù)關(guān)系用2一陰繃MCt來(lái)計(jì)算[’“”2]。根據(jù)標(biāo)化后的表達(dá)量采用Student’St檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。胞株HBV分泌抗原表達(dá)情況細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)HBV特異抗原的表達(dá)情況均能表達(dá)HBsAg和HBeAg(見(jiàn)圖1.1)，且隨著細(xì)胞培HBsAg和HBeAg含量逐漸增高。

TRIZOL提取RePSal一1和RHBV-3細(xì)胞株總RNA，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD26。、OD28。及比值，以確定RNA的濃度及純度，將其濃度調(diào)至0.5卜留川。OD26夕ODZ，。t匕值為 1.81，1.2%凝膠電泳成像(圖1.2)。飾M妞E巴VJ月坤-今龍翔甲1側(cè)抑十-55圖1.2細(xì)胞抽提RNA凝膠電泳分析M:分子量Marker;sal:Repsal一l細(xì)胞;HBv:刃侶V-3細(xì)胞2、預(yù)實(shí)驗(yàn)PcR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析(見(jiàn)圖1.3)bP20001000750500250100 M12345678 91011圖1.3預(yù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析M:DNA分子量 markerDLZO00;l:JUN;2:Mve;3:Ras;4:Fos5:MMPZ6:MMPg:7:TIMPI;8:TIMPZ;9:TIMP3;10:TIMP4:1]:GAPDH3、Real一 timePCR分析采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)所選的10個(gè)基因及內(nèi)參照基因GAPDH進(jìn)行mRNA相對(duì)定量檢測(cè)，繪制擴(kuò)增曲線(見(jiàn)圖1.4)、融解曲線(見(jiàn)圖1.5)、計(jì)算Ct值(見(jiàn)表1.2)。檢測(cè)結(jié)果表明，擴(kuò)增體系良好。融解曲線顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物特異。各檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平根據(jù)管家基因GAPDH的均值進(jìn)行標(biāo)化，比較標(biāo)化后pREP一HBV細(xì)胞與
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62;R735.7

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本文編號(hào)：2628259