【摘要】： 研究背景 急性胰腺炎是以胰腺間質(zhì)水腫、出血、腺泡細胞空泡變性、壞死及炎癥細胞浸潤為病理特征、病變程度不一、結(jié)局難以預(yù)料的急性炎癥性疾病。急性胰腺炎常伴有全身炎癥反應(yīng),約20%發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP),其病死率可高達30%-50%。隨著國人生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的變化,我國急性胰腺炎(包括重癥胰腺炎)的發(fā)病呈現(xiàn)增高的趨勢。因此,SAP是目前我國常見的、嚴重威脅人類健康的重大疾病。 急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(acute pancreatitis-associated lung Injury, APALI)是急性重癥胰腺炎最早出現(xiàn)、最常見、也是最為嚴重的全身并發(fā)癥。急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷發(fā)病機制復(fù)雜,近年來很多實驗性研究集中在炎性細胞和炎性介質(zhì)激活途徑上,一般認為肺損傷是全身炎癥反應(yīng)在肺部的局部表現(xiàn),而肺臟由于其組織特異性易于發(fā)生炎性損傷。積累的大量證據(jù)表明胰腺實質(zhì)中活化的單核巨噬細胞、多核粒細胞釋放的TNF-α、LI-1和IL-6等多種促炎細胞因子不僅有助于啟動急性胰腺炎局部炎癥的形成和發(fā)展,而且也是導(dǎo)致包括肺損傷在內(nèi)全身炎癥反應(yīng)的重要細胞因子,促炎因子的過表達不僅加重了急性胰腺炎的損傷程度,同時也加重了胰腺炎相關(guān)性肺損傷的的嚴重程度。所以降低重癥胰腺炎肺組織中炎癥因子的水平一直是人們研究如何治療急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的方向。大量的動物實驗證明,降低全身或肺組織中炎性細胞因子的水平對急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷具有治療作用。但是在急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的發(fā)病過程中引起肺組織中炎性細胞因子水平增加的原因和機制目前尚不清楚,只有在發(fā)病機制上找到原因才能給我們對急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的治療帶來理論指導(dǎo),從而大大降低急性重癥胰腺炎的死亡率。 最近,JNK信號通路在急性胰腺炎發(fā)病中所起的作用越來越受到人們的關(guān)注。研究顯示,在急性胰腺炎的動物模型中,JNK信號通路被激活,JNK信號通路的激活與炎癥因子密切相關(guān),JNK信號通路被激活是胰腺損傷的早期事件,運用JNK通路特異性阻斷劑SP600125,可以通過抑制JNK信號通路的激活來下調(diào)TNF-α、ICAM-1、IL-1β等促炎癥因子的表達,明顯減輕胰腺的病理損害,對急性胰腺炎具有治療作用。由此可見JNK信號通路在急性胰腺炎的發(fā)病過程中起著重要的作用。同時人們發(fā)現(xiàn)JNK信號通路的激活在肺損傷的發(fā)病過程中起著重要的作用,體外動物實驗表明,JNK信號通路的激活在鎳、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷中起著重要的作用,而且應(yīng)用特異性JNK信號通路阻斷劑對肺損傷的治療,特別是脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(一種被認為與急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷有相同的發(fā)病途徑)的治療均取得了一定的效果。但到目前為止,JNK信號通路在急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷中的作用機制尚不清楚。 本實驗分為兩個部分：第一部分JNK通路在急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的作用及其機制；第二部分：丹參酮ⅡA對急癥胰腺炎相關(guān)性肺損傷的干預(yù)作用。 第一部分：JNK通路在急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的作用及其機制 目的 本研究旨在觀察JNK信號通路在�；悄懰徕c誘導(dǎo)的大鼠急性出血壞死性胰腺炎肺組織中的激活情況,并探討JNK信號通路激活與肺組織損傷程度的相關(guān)性；同時應(yīng)用特異性JNK通路阻斷劑SP600125,進一步證實JNK信號通路激活在急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷發(fā)病過程中所起的作用。 方法 SD大鼠72只,分為3組,每組24只。S組：假手術(shù)對照組,24只大鼠,開腹后翻動大鼠十二指腸并輕觸胰腺數(shù)次,縫合腹部；SAP組：以1ml／kg的劑量逆行胰膽管注射滅菌5%�；悄懰徕c,誘導(dǎo)大鼠急性出血壞死性胰腺炎模型,這種模型類似于人類的重癥胰腺炎；SP600125干預(yù)組：在急性出血壞死性胰腺炎大鼠模型誘導(dǎo)前30分鐘,以15mg／kg的劑量通過腹腔注射SP600125；每組分3小時、6小時、12小時和24小時4個時間點,各時間點大鼠數(shù)目為6只。按計劃于各時間點處死大鼠,收集血清及胰腺和肺組織。肺水腫嚴重程度以肺組織濕干重比表示；以碘一淀粉比色法測定血清淀粉酶,ELISA方法測定肺組織TNF-α水平和工L-1β水平,H.E染色用于胰腺和肺組織損傷的病理學(xué)評價,采用分光光度計測定肺組織中髓過氧化酶(MPO)、免疫組化方法測定肺組織中ICAM-1表達,用Westernblot方法對肺組織中JNK和PJNK進行蛋白定量。 結(jié)果 假手術(shù)對照組3hr、6hr、12hr、24hr血清淀粉酶分別為501±85、512±91、518±94和532±86,胰腺病理損傷評分為0；肺臟病理損傷評分為0,肺濕干重比為2.29±0.10、2.22±0.23、2.17±0.11和2.31±0.13；肺臟MPO活性為1.33±0.56、1.56±0.43、1.51±0.23和1.47±0.48；肺組織IL-1β含量為80.3±21.2、92.3±23.5、87.3±19.4和89.7±22.1；肺組織TNF-α含量為70.6±21.2、67.6±19.8、68.4±19.5和74.5±22.6；肺組織ICAM-1免疫組化陽性積分S組0.11±0.01、0.17±0.02、0.14±0.02和0.16±0.09；PJNK相對光密度值為0.65±0.12。SAP組3hr、6hr、12hr、24hr血清淀粉酶分別為2506±215、3701±264、4101±411和3212±295；胰腺病理損傷評分8.24±0.63、10.65±1.02、14.00±0.96和14.09±0.75；肺臟病理損傷評分為3.0±0.4、4.7±0.7、7.5±0.3和6.5±0.7；肺濕干重比為3.52±0.42、3.96±0.15、4.53±0.08和4.26±0.12；肺臟MPO活性為5.64±0.76、6.44±0.77、7.19±0.83和7.36±0.71；肺組織IL-1β含量211.2±19.3、315.4±34.2、399.2±43.2和353.4±38.3；肺組織TNF-α含量為348.5±42.8、433.5±63.4、394.3±56.3和365.3±39.9；肺組織ICAM-1免疫組化陽性積分為0.8±0.09、104±0.11、1.44±0.12和1．22±0.13；PJNK相對光密度值為1.03±0.22、1.24±0.17、1.38±0.21、1.28±0.24。與假手術(shù)對照組相比,SAP組在各個時間點的血清淀粉酶、胰腺病理損傷評分和肺臟病理評分均顯著增高(P0.05),我們成功的建立了重癥胰腺炎相關(guān)性肺損傷的動物模型,SAP組個時間點的肺濕干重比、MPO活性、IL-1β含量、TNF-α含量、ICAM-1表達均明顯增高,JNK蛋白總量無變化,但各時間點的PJNK蛋白均顯著高于假手術(shù)對照組(P0.05)。應(yīng)用特異性JNK信號通路阻斷劑SP600125后,檢測肺組織3hr、6hr、12hr和24hr肺臟病理損傷評分為2.1±0.3、3.2±0.2、6.0±0.7和4.0±0.3；肺濕干重比為SP600125組3.08±0.09、3.54±0.22、3.35±0.16和3.01±0.38；肺臟MPO活性為3.36±0.36、4.27±0.52、5.16±0.26和5.46±0.61(單位：u／g)；肺組織IL-1β含量為154.3±11.2、221.4±21.5、289.4±23.4和267.7±15.1(單位：pg／mg)肺組織TNF-α含量為243.8±32.3、317.6±22.8、272.3±20.5和225.5±32.6(單位：pg／mg)；肺組織ICAM-1免疫組化陽性積分為0.59±0.18、0.77±0.20、0.84±0.23、0.93±0.31；PJNK相對光密度值為0.69±0.14、0.58±0.22、0.85±0.17、0.18±0.05。與SAP組相比,SP600125組各個時間點的肺濕干重比、MPO活性、IL-1β含量、TNF-α含量、ICAM-1表達均明顯降低,JNK蛋白無明顯變化,但PJNK蛋白顯著降低,同時肺臟病理損傷評分明顯改善(P0.05)。通過相關(guān)性比較我們發(fā)現(xiàn),肺組織PJNK表達與肺病理損傷評分存在顯著相關(guān)性(P0.05)。 結(jié)論： 1、利用5%�；悄懰徕c逆行大鼠胰膽管注射可建立良好的APALI動物模型,為研究APALI的機制及探討防治策略提供了試驗平臺。 2、JNK通路激活是重癥胰腺炎相關(guān)性肺損傷發(fā)病的早期事件,其激活可能參與了APALI的發(fā)生和發(fā)展。 3、應(yīng)用JNK通路阻斷劑對急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷有治療作用, 第二部分：丹參酮ⅡA對急癥胰腺炎相關(guān)性肺損傷的治療作用 目的 評價傳統(tǒng)中藥丹參酮的有效單體丹參酮ⅡA對大鼠急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷是否具有治療作用,并初步探討其治療機理。 方法 SD大鼠72分為3組,每組24只。S組：假手術(shù)對照組,24只大鼠,開腹后翻動大鼠十二指腸并輕觸胰腺數(shù)次,縫合腹部；SAP組：以lml／kg的劑量逆行胰膽管注射滅菌5%牛磺膽酸鈉,誘導(dǎo)大鼠急性出血壞死性胰腺炎模型,這種模型類似于人類的重癥胰腺炎；丹參酮ⅡA組：在急性出血壞死性胰腺炎大鼠模型誘導(dǎo)前30分鐘,以20mg／kg的劑量通過腹腔注射丹參酮ⅡA。每組分3小時、6小時、12小時和24小時4個時間點,各時間點大鼠數(shù)目為6只。按計劃于各時間點處死大鼠,收集血清及胰腺和肺組織。肺水腫嚴重程度以肺組織濕干重比表示；以碘一淀粉比色法測定血清淀粉酶,ELISA方法測定肺組織TNF-α水平和IL-1β水平,H.E染色用于胰腺和肺組織損傷的病理學(xué)評價,采用分光光度計測定肺組織中髓過氧化酶(MPO)、免疫組化方法測定肺組織中ICAM-1表達,用Westernblot方法對肺組織中JNK和PJNK進行蛋白定量。 結(jié)果 S組肺濕干重比為、2.12±0.23、2.15±0.11和2.33±0.23；肺臟MPO活性為1.23±0.26、1.66±0.33、1.54±0.21和1.42±0.28；肺組織IL-1β含量為82.3±11.2、95.3±21.5、82.3±18.4和92.7±21.1；肺組織TNF-α含量為72.6±11.2、69.6±13.8、69.4±12.5和77.5±21.6；肺組織ICAM-1免疫組化陽性積分S組0.11±0.01、0.17±0.02、0.14±0.02和0.16±0.09；SAP組肺臟病理損傷評分為3.1±0.3、4.6±0.6、7.6±0.3和6.6±0.7；肺濕干重比為3.62±0.43、3.98±0.35、4.54±0.28和4.27±0.12；肺臟MPO活性為5.66±0.66、6.47±0.73、7.21±0.84和7.41±0.72；肺組織IL-1β含量212.2±18.3、319.4±32.2、402.2±41.2和357.4±34.3；肺組織TNF-α含量為351.5±41.8、443.5±53.4、397.3±51.3和365.3±37.9；肺組織ICAM-I免疫組化陽性積分為0.81±0.09、1.14±0.11、1.45±0.12和1.26±0.13。應(yīng)用丹參酮ⅡA干預(yù)后,我們檢測肺組織中3hr、6hr、12hr和24hr時間點各項指標的結(jié)果分別為：肺濕干重比為3.17±0.29、3.24±0.22、3.49±0.26和3.21±0.38；肺組織MPO活性為4.03±0.39、4.75±0.55、5.66±1.26和5.45±0.719(單位：u／g)；肺組織IL-1β含量為174.3±15.2、211.4±17.5、297.7±21.4和277.9±15.6(單位：pg/mg);肺組織TNF-α含量為253.8±27.3、337.6±22.3、312.3±22.5和311.5±32.6(單位：pg／mg)；肺組織ICAM-1免疫組化陽性積分為0.63±0.15、0.82±0.19、1.01±0.23和0.96±0.31；肺臟病理損傷評分為2.2±0.3、3.6±0.2、6.3±0.7和5.1±0.3；PJNK相對光密度值為1.15±0.08、1.05±0.23、1.34±0.18、0.74±0.16。與SAP組相比,PJNK蛋白顯著減少(P0.05),肺組織濕干重比、肺組織中MPO活性、細胞因子IL-1β和TNF-α的含量、肺組織中ICAM-1的表達均顯著性減少(P0.05),同時肺臟病理損傷評分顯著改善(P0.05)。 結(jié)論 1、丹參酮ⅡA對實驗動物的APALI具有治療作用 2、抑制JNK信號通路可能是丹參酮ⅡA治療作用的重要機制
【圖文】：

3.各組間肺組織MP。的活性變化各組間肺組織MPO的活性變化見表2一3圖2一3，丹參酮IIA預(yù)處理后3hr時間點與SAP無顯著性差異，6hr、12hr、24hr點的MPO活性均顯著性低于SAP組。丹參酮llAMPO活性在各時間仍高于假手術(shù)對照組汀代0.05)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較有顯著性差異汀人(0.05)。表2一3:各組間肺組織MPO(宙g)的活性變化組別3hr6hr12hr24hrS組1.23士0.261.66士0.331.54士0.211.42士0.28SAP組5.66士0.66▲6.47士0.73盛7.21士0.84▲7.41士0.72▲丹參酮IIA組4.03士0.39*‘4.75士0.55▲*5.66士1.26▲*5.45士0.71▲*▲與S組相比，各時間點子KO.05★與SAP組相比，各時間點了戈之0.05

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【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R576;R285

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳秋玲;JNK選擇性抑制劑對雌激素誘導(dǎo)的ICP孕鼠肝細胞Bsep、Ntcp表達的影響[D];中南大學(xué);2012年

本文編號：2628221