【摘要】：流行性乙型腦炎病毒（JEV）主要由三帶喙庫蚊傳播的自然疫源性疾病，豬群是JEV儲存宿主，在乙型腦炎的流行中起重要作用。JE在亞洲地區(qū)普遍流行，每年約3-5萬人感染，死亡1-1.5萬人。乙腦病毒同樣也給養(yǎng)豬行業(yè)，尤其是我國西南地區(qū)畜牧業(yè)原本不發(fā)達(dá)地區(qū)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，母豬感染病毒后可出現(xiàn)流產(chǎn)、仔豬發(fā)育不良或木乃伊胎等癥狀。 云南省景洪市位于中緬邊境，屬于蟲媒病毒病流行的主要地區(qū)，因此在該地區(qū)開展蟲媒病毒調(diào)查尤其是乙型腦炎病毒的分子流行病學(xué)研究有重大意義。本研究對云南景洪地區(qū)蚊蟲和豬腦組織樣品進(jìn)行JEV分子流行病學(xué)調(diào)查，用常規(guī)PCR方法檢測430份蚊蟲樣品和108份豬腦組織樣品擴(kuò)增JEV Ⅰ和JEV Ⅲ保守區(qū)NS1非結(jié)構(gòu)蛋白基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蚊蟲樣品中C. tritaeniorhynchus（三帶喙庫蚊）JEV感染率為13.2%（57/430）， A. sinensis（中華按蚊）為2.7%（3/430），A. subalbatus（騷擾阿蚊）0.7%（3/430），，仔豬腦組織樣品陽性率為18.5%（20/108）。并從陽性樣品擴(kuò)增JEV結(jié)構(gòu)蛋白基因E，結(jié)果從C.tritaeniorhynchus、A. sinensis和豬樣品中分別得到8份、5份和3份陽性結(jié)果。對這16份樣品進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)與基因Ⅲ型JEV序列相似率最高為99.7%。未檢測出基因Ⅰ型JEV�？梢酝茰y基因Ⅲ型JEV是云南地區(qū)主要流行基因型。我們又用云南省寄生蟲防治所提供的人和豬JEV E基因序列進(jìn)行進(jìn)一步對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)云南省蚊源中（Cx.tritaeniorhynchus6個、A n.sinensis4個）JEV序列分別與人源JEV序列完全相同，而豬源JEV與人源JEV序列相似率為96.2%-98.6%，親緣關(guān)系比較接近。 本次流行病學(xué)調(diào)查成功從豬腦組織和蚊蟲樣品中成功分離出2株JEV病毒Yunnan0901和Yunnan0902株（GenBank accession numbers JQ086762和JQ086763）。獲得2株JEV Ⅲ全基因序列，并與以前在其它地區(qū)和時間分離的JEV全基因進(jìn)行對比分析。其中Yunnan0901株和Yunnan0902株5’-NCR端均有1個堿基發(fā)生置換，置換率均為1.05%而氨基酸均未發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)蛋白基因中Capsid基因分別有2和1個堿基發(fā)生置換，置換率分別為0.52%和0.26%Yunnan0901株氨基酸未發(fā)生改變而Yunnan0902株則有1個氨基酸發(fā)生改變。Membrane基因分別有3和1個堿基發(fā)生置換，置換率分別為0.59和0.20%，Yunnan0902株氨基酸未發(fā)生改變而Yunnan0901株則有1個氨基酸發(fā)生改變。Envelope基因分別有10個和4個堿基發(fā)生置換，置換率分別為0.67%和0.27%Yunnan0901株有9個、Yunnan0902株有3個氨基酸發(fā)生改變， NS5基因分別有25個和16個堿基發(fā)生置換，置換率為0.91%和0.59%其中Yunnan0901株有18個、Yunnan0902株有9個氨基酸改變。3’-NCR端堿基均未改變。該結(jié)果說明豬是病毒的儲存宿主而且容易引起病毒的變異。將Yunnan0901和Yunnan0902分離株的E基因與93株JEV E基因進(jìn)行對比，為JEV的基因進(jìn)化提供依據(jù)。 由于乙腦病毒的分離只有在病毒血癥時期的外周血中可分離到。目前最常用的豬JEV診斷是用ELISA方法，檢查血液或腦脊液中抗體。但是血清學(xué)方法在檢查JEV時會與其他病毒有較大的交叉反應(yīng)。常用的豬乙型腦炎病毒檢測主要是RT-PCR和real-time PCR方法，而這兩種方法雖然檢測較靈敏但是需要昂貴的設(shè)備和有經(jīng)驗的操作人員。而近些年LAMP檢測方法依靠高靈敏性、準(zhǔn)確性、簡便性等特點被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)檢測機(jī)構(gòu)。 因此，我們以此為出發(fā)點研發(fā)一種簡便快速準(zhǔn)確的用于現(xiàn)場和基層監(jiān)測部門的豬乙型腦炎診斷方法。根據(jù)JEVⅠ（K94PO5）和JEV Ⅲ（SA14-14-2）株設(shè)計LAMP擴(kuò)增引物。優(yōu)化反應(yīng)體系結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP與real-time PCR靈敏性和準(zhǔn)確性基本相似，但是LAMP更加節(jié)省時間而且對儀器設(shè)備的要求較低，擴(kuò)增過程僅需要一個恒溫水浴鍋即可。LAMP與常規(guī)PCR相比其優(yōu)勢更加明顯，不僅節(jié)省時間而且其靈敏度是常規(guī)PCR的100倍。樣品檢測LAMP檢測結(jié)果與病毒分離方法完全一致。 在疫苗研究方面目前尚未有專門用于豬的乙型腦炎病毒疫苗，都是用人用的弱毒疫苗SA14-14-2株來代替免疫。雖然免疫效果較好但是SA14株存在毒力返強(qiáng)的趨勢免疫后可能引起動物發(fā)病，所以我們有必要研發(fā)一種獸用新型乙型腦炎病毒疫苗。E蛋白抗原可誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體和CTLs效應(yīng)，用該抗原生產(chǎn)的疫苗可以區(qū)分野毒感染還是疫苗株毒力返強(qiáng)而引起動物發(fā)病。 痘苗病毒基因組較大，可插入大量外源基因，而且非必須基因多刪除后不影響病毒的復(fù)制和功能。本研究構(gòu)建了的乙型腦炎重組痘苗病毒疫苗含有乙型腦炎病毒E抗原，而且敲除了痘苗病毒TK和E3L基因使病毒達(dá)到致弱的目的。我們將乙腦病毒E基因插入到復(fù)制缺失型（E3L）的痘苗病毒基因組中并成功表達(dá)。經(jīng)過Western blot分析E蛋白成功表達(dá)。而且表達(dá)的E蛋白產(chǎn)物有生物學(xué)功能。重組痘苗病毒可誘導(dǎo)乙腦病毒特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，肌肉免疫小鼠和豬實驗發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的抗體水平也高于弱毒疫苗和其他免疫組（P 0.05）。豬中和抗體實驗也進(jìn)一步證明這一結(jié)果。小鼠淋巴細(xì)胞增殖實驗證明JEV特異性刺激結(jié)果免疫組間SI指數(shù)，2次重組痘苗病毒免疫組（1.86）弱毒疫苗免疫組（1.59）1次重組痘苗病毒免疫組（1.37）痘苗病毒缺失免疫組（1.21）PBS免疫組（1.01）。豬淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果2次重組痘苗病毒疫組（1.65）弱毒疫苗免疫組（1.45）1次重組痘苗病毒免疫組（1.29）痘苗病毒缺失免疫組（1.16）PBS組（1.02）。小鼠和豬JEV的刺激其結(jié)果說明，重組痘苗病毒免疫組刺激指數(shù)（SI）顯著高于其他組（P 0.05）證明其可有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，提高了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答。 細(xì)胞免疫應(yīng)答是抵抗乙腦病毒感染的重要保護(hù)性免疫。IL-4和IL-10是評價Th2類細(xì)胞分化的重要指標(biāo)。IFN-γ和IL-2，一般被認(rèn)為是Th1類細(xì)胞因子，同樣可誘導(dǎo)Th2類細(xì)胞的產(chǎn)生。我們從小鼠免疫實驗IFN-γ結(jié)果，2次重組痘苗病毒疫組（1207）弱毒疫苗免疫組（870）1次重組痘苗病毒免疫組（688）痘苗病毒缺失免疫組（367）PBS組（197）。IL-4結(jié)果，2次重組痘苗病毒疫組（728）弱毒疫苗免疫組（603）1次重組痘苗病毒免疫組（460）痘苗病毒缺失免疫組（230）PBS（117）。重組痘苗病毒免疫組各細(xì)胞因子水平顯著高于PBS對照組（p0.05）。 豬免疫試驗IFN-γ結(jié)果，2次重組痘苗病毒免疫組（1078）弱毒疫苗免疫組（866）1次重組痘苗病毒免疫組（778）痘苗病毒缺失免疫組（474）PBS組（329）。IL-4結(jié)果，2次重組痘苗病毒免疫組（469）弱毒疫苗免疫組（393）1次重組痘苗病毒免疫組（320）痘苗病毒缺失免疫組（221）PBS免疫組（107）。重組痘苗病毒免疫組各細(xì)胞因子水平顯著高于PBS對照組（p0.05）。 以上結(jié)果表明，重組痘苗病毒疫苗免疫小鼠和豬后可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。小鼠和豬的攻毒保護(hù)試驗證明，重組痘苗病毒疫苗對小鼠（5/5）和豬（5/5）均有很好的保護(hù)效力這一結(jié)果顯著高于弱毒疫苗免疫組和其他對照組。而且與其他免疫組相比明顯降低豬病毒血癥的發(fā)生臨床癥狀明顯減小，因此我們所研發(fā)的新型重組痘苗病毒乙型腦炎疫苗的安全性、有效性和制作簡單等特點有望成為現(xiàn)有乙腦病毒疫苗替代品。
【圖文】：

圖 1.1 中國云南省景洪地區(qū)蚊蟲采集區(qū)域ure 1.1 Map of Jing Hong in Yunnan Province， where the samples were coll胞、 菌種和克隆載體-21 細(xì)胞由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究病毒室保存，大受態(tài)菌購自 TaKaRa 公司，克隆載體 pMD18-T 購自大連 TaKaRa 公司。胞培養(yǎng)試劑M 細(xì)胞培養(yǎng)液、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、雙抗購自 HyClone 公司；RNA 提取試司。JEV 陽性抗體本實驗室保存；其他化學(xué)試劑均為分析純由本實驗室具酶及化學(xué)試劑 提取試劑盒購自 TaKaRa 公司，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶為 Promega 公司產(chǎn)品酶、DNA Marker 均購于 Takara 公司，分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 大連寶生物公司產(chǎn)品、其他化學(xué)試劑均為分析純由本實驗室提供。要儀器和耗材le 公司高速低溫離心機(jī)和常溫離心機(jī)，Pharmacia 公司 DNA/RNA公司-70℃超低溫冰箱，天能公司的 GIS 凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司水

圖1.2 JEV Ⅲ和JEVⅠ NS1 及E基因的RT-PCR擴(kuò)增plified products of JEV Ⅲ NS1 gene (A)and JEVⅠE gene(B)by RT-PCR fr M：DL2000 DNA Marker;1-2. The PCR product of gene NS1; 3:The PCR Encephalitis virus as positive control ;4: Negative control表1.10 2009-2010年景洪地區(qū)檢測的蚊蟲和豬腦樣品JEV陽性率V E基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果thNo Mosquito 和swine testedNo.（%） Mosquito 和 swine posiMosquito(50/tube)SwinebrainCx.tritaeniorhynchus An.sinensis Ar.subalbat75 15 9（12） 3（4.0） 0 66 20 12（18） 4（6.0） 2（3.0） 65 10 10（15） 2（3.0） 1（1.5）82 21 8（9.7） 1（1.2） 0 74 25 10（13.5） 2（2.7） 0 68 17 8（11.7） 0 0 430 108 57（13.2） 12（2.7） 3（0.7）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62;Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 項秉懿;陳蘇民;;乙型腦炎病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];中國病毒學(xué);1993年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 楊耀武;流行性乙型腦炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表達(dá)及ELISA診斷試劑盒的研制[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

2 孫圣福;日本乙型腦炎實驗室診斷方法的研究和應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

本文編號：2627168