【摘要】： 背景與目的:肝臟是膽酸合成、分泌、膽汁形成及其再循環(huán)(腸肝循環(huán))的重要器官。膽汁淤積是指膽汁的生成和/或膽汁內(nèi)溶質(zhì)排出障礙,一些正常從膽汁中排泄的物質(zhì)如膽酸、膽紅素和膽固醇在血液內(nèi)異常堆積[1,2]。而膽酸、膽紅素等物質(zhì)的排泄則主要靠肝細(xì)胞膜上的膽酸轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng),它們包括MRPsOATPsNTCPBsep等等[3]。其中,MRPs(multidrug resistance-assocated proteins)家族,是一類非常重要的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白,屬于ABC轉(zhuǎn)運體超家族,目前已知至少有9種(MRP1-9)。主要分布于肝臟腎臟腸道等器官組織。MRPs的分子結(jié)構(gòu)基本都包含跨膜區(qū)(TMD)與核苷酸結(jié)合域(NBD)。它們的主要功能是轉(zhuǎn)運葡萄糖醛酸結(jié)合物GSH硫酸鹽或某些抗癌藥物等等[4]。 多耐藥相關(guān)蛋白3(multidrug resistance-assocated protein 3,MRP3)是近年新克隆的一種轉(zhuǎn)運蛋白基因,主要分布于腸道、腎臟及腎上腺,而在正常肝細(xì)胞基底側(cè)膜上表達(dá)很低或不表達(dá)[5]。但是在膽道結(jié)扎所致的急性膽汁淤積大鼠模型的肝臟中MRP3的表達(dá)量卻非常高[6]。同時進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在人類膽汁淤積性疾病(如:膽道梗阻、原發(fā)性毛細(xì)膽管性肝硬化、Dubin-Johnson綜合征)時,MRP3在肝細(xì)胞基底側(cè)膜表達(dá)量也大為增加,而同時肝細(xì)胞小管面的MRP2的表達(dá)量卻急劇下降[7]。隨著對MRP3轉(zhuǎn)運功能研究進(jìn)一步的深入,發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)運底物與MRP2具有廣泛的同源性,都能轉(zhuǎn)運大部分膽酸,尤其是結(jié)合型膽酸,因此,MRP3的高表達(dá)被認(rèn)為是代償性的,以補(bǔ)償小管面膜上MRP2的下調(diào)。所以,人們普遍認(rèn)為MRP3的表達(dá)增高是在膽汁淤積狀態(tài)下肝細(xì)胞的一種代償性自我保護(hù)反應(yīng)[6,8]。因此,隨著對MRP3調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的進(jìn)一步研究深入,有可能在不久的將來開發(fā)出治療膽汁淤積疾病的特效藥物,并且對臨床尋找肝膽汁淤積治療對策也具重要的臨床價值。 當(dāng)膽汁淤積發(fā)生時,肝臟MRP3基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)與核受體CPFRXRαRARαSp1PXR等基因相關(guān)。已經(jīng)有文獻(xiàn)報道,在體外細(xì)胞培養(yǎng)與膽道結(jié)扎的動物模型實驗研究表明,核受體CPF/Lrh-1能夠上調(diào)MRP3/Mrp3 mRNA的表達(dá)[6];RXRα:RARα異二聚體則能夠抑制MRP3的表達(dá)[9]。Sp1,PXR等也對MRP3的基因表達(dá)起一定的調(diào)節(jié)作用[10],但是其具體機(jī)制尚不清楚。而且目前的實驗研究主要集中在體外細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型實驗,直接針對以“人”為研究對象的實驗鮮有報道,人體組織的研究結(jié)果與體外細(xì)胞培養(yǎng)或動物實驗常存在差異,如:用內(nèi)毒素處理的大鼠Mrp2 mRNA的表達(dá)水平急劇下降,而當(dāng)以“人”為研究對象時MRP2 mRNA的表達(dá)水平卻維持不變,但是二者M(jìn)rp2/MRP2蛋白水平的變化卻均急劇降低[11]。本實驗通過收集40例人體肝組織標(biāo)本,對阻塞性膽汁淤積時MRP3上調(diào)相關(guān)的基因進(jìn)行研究,從而進(jìn)一步探討與研究阻塞性膽汁淤積時人肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白MRP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 方法 通過對收集的40例標(biāo)本分組(對照組:正常肝組織;淤膽組:淤膽肝組織)后,分別在mRNA水平(RT-PCR)與蛋白水平(Western blot)檢測分析膜轉(zhuǎn)運蛋白MRP3表達(dá)變化,以及與其調(diào)節(jié)相關(guān)核受體基因CPFRXRα與RARα表達(dá)變化。通過免疫熒光檢測膜轉(zhuǎn)運蛋白MRP3與核受體CPF在正常肝與淤膽肝組織的表達(dá)以及定位情況。通過EMSA來檢測MRP3基因啟動子區(qū)反應(yīng)元件與核受體CPF結(jié)合活性在正常肝與淤膽肝組織的變化。 結(jié)果 1.阻塞性膽汁淤積時,通過RT-PCR實驗研究對膜轉(zhuǎn)運蛋白基因MRP3與核受體基因CPFRXRαRARα等在mRNA水平表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果表明:MRP3以及上述基因在mRNA水平表達(dá)均顯著增高,增高約3~4倍左右。 2.免疫熒光檢測結(jié)果表明,阻塞性膽汁淤積時,膜轉(zhuǎn)運蛋白MRP3在肝細(xì)胞基底側(cè)膜的表達(dá)明顯增加。而CPF的表達(dá),在核內(nèi)與胞漿內(nèi)均有增加。 3.人肝臟阻塞性膽汁淤積時,通過Western blot實驗對膜轉(zhuǎn)運蛋白基因MRP3與核受體基因CPFRXRαRARα等在蛋白水平表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果表明: MRP3蛋白水平表達(dá)增高約4倍。CPFRXRαRARα在核內(nèi)表達(dá)增高約6~8倍;而在胞漿內(nèi),RARα顯著增高約13倍;RXRα增高約2.5倍,CPF增高約4倍。 4.人肝臟阻塞性膽汁淤積時,通過EMSA檢測結(jié)果表明:MRP3基因啟動子區(qū)反應(yīng)元件與核受體CPF結(jié)合活性顯著增加,約3.5倍。 討論 MRP3(ABCC3)在正常肝細(xì)胞膜低表達(dá)或不表達(dá)。而當(dāng)膽汁淤積發(fā)生時,肝細(xì)胞基底側(cè)膜的MRP3表達(dá)卻顯著增高。同時,又由于MRP3轉(zhuǎn)運底物與MRP2有著廣泛的同源性,所以人們普遍認(rèn)為MRP3的高表達(dá)是對MRP2的一種代償,以減輕膽汁淤積時肝細(xì)胞受膽酸毒性損傷的程度,具有護(hù)肝的作用。因此,對MRP3表達(dá)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的研究,對尋找膽汁淤積治療對策有著非常重要的臨床意義。 本實驗通過對人體肝組織標(biāo)本研究分析得知,阻塞性膽汁淤積時人肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白MRP3在肝細(xì)胞基底側(cè)膜的表達(dá)量顯著增高。MRP3基因啟動子區(qū)反應(yīng)元件與核受體CPF結(jié)合活性顯著增高,這些充分證明核受體CPF能夠上調(diào)人肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白MRP3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)功能。這與先前相關(guān)文獻(xiàn)報道的體外細(xì)胞培養(yǎng)以及膽道結(jié)扎的膽汁淤積動物模型的實驗結(jié)果相一致[5,6,7,8,9]。而核受體RXRαRARα不論是在mRNA水平還是蛋白水平均顯著增高,這與文獻(xiàn)報道的體外細(xì)胞培養(yǎng)以及膽道結(jié)扎的膽汁淤積動物模型的實驗結(jié)果結(jié)果相反[9]。尤其值得注意的是,核受體蛋白RARα在胞漿內(nèi)的表達(dá)增高約13倍,而在核內(nèi)增高約6倍,這與RXRαCPF在核內(nèi)以及胞漿的表達(dá)增高的情況相反。這可能提示RARα進(jìn)入細(xì)胞核后,在某些因素的作用下,引起它由細(xì)胞核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的核外轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,這需要進(jìn)一步的研究證實。以上實驗結(jié)果充分說明了人肝臟MRP3調(diào)節(jié)的分子機(jī)制與膽道結(jié)扎動物模型或體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗所建立的調(diào)節(jié)機(jī)制存在某些差異。另外,核受體蛋白RXRαRARαCPF在胞漿與核內(nèi)的分布可能還存在差異,這可能提示其他的調(diào)節(jié)機(jī)制也參與了MRP3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 結(jié)論 通過本實驗研究,我們證實了人肝臟阻塞性膽汁淤積時核受體CPF對MRP3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有上調(diào)的功能。核受體RXRα、RARα在膽汁淤積時表達(dá)顯著增高,這與相關(guān)文獻(xiàn)報道的膽道結(jié)扎動物模型或體外細(xì)胞培養(yǎng)的實驗結(jié)果不同,這可能提示其他的調(diào)節(jié)機(jī)制也參與了MRP3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),有待進(jìn)一步深入研究。
【圖文】：

總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖 2-2 GAPDH 瓊脂糖凝膠電泳圖00.511.522.51 21.對照組 2.淤膽組P<0..001MRP 3 m RNA水平的表達(dá)MRP3/GADPH的O.D.值比圖 2-3 MRP3 mRNA 水平的變化統(tǒng)計學(xué)分析先進(jìn)行內(nèi)參 GAPDH 的 RT-PCR，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測。用軟件分析其條其灰度值進(jìn)行上樣量的調(diào)整。內(nèi)參 GAPDH 的 PCR 反應(yīng)至少要重復(fù) 3 次，以。4(-)常正8(-)常正8(+)膽淤12(+)膽淤9(+)膽淤1(-)常正7(-)常正19(-)常正21(-)常正6(+)膽淤2(+)膽淤10(+)膽淤**：
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575

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本文編號：2625040