【摘要】：研究背景與目的:炎癥性腸病(Inflammatory bowel diease,IBD)是一種病因尚未明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’disease,CD)。一般認為該疾病由遺傳易感性、免疫紊亂、腸屏障障礙以及腸道菌群失衡等多因素所致。臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和血便等,病程慢性持續(xù)、反復發(fā)作,隨著環(huán)境、飲食習慣、工作壓力等變化,該疾病逐年上升,已成為全球性疾病,對社會經濟產生重大影響。腸上皮屏障功能缺陷是介導IBD發(fā)生發(fā)展的重要因素,而緊密連接被認為是腸上皮屏障的結構基礎,緊密連接主要由膜周蛋白ZO、跨膜蛋白Occludin、Claudin和調節(jié)蛋白等組成。該結構基礎的破壞會導致腸上皮通透性增加,引發(fā)黏膜免疫應答紊亂和慢性腸炎。生理條件下,人體腸道中存在大量細菌及其代謝產物,憑借腸上皮機械屏障、粘膜免疫系統(tǒng)及粘液屏障等調控作用,維持腸道內環(huán)境的穩(wěn)定。很多研究表明,腸道粘膜免疫對腸道菌群起著重要的調控作用。調節(jié)腸道菌群可以在一定程度上緩解患者癥狀,減輕粘膜炎癥。免疫抑制劑的應用也是激素依賴型IBD患者的重要治療手段。程序性死亡受體-1(PD-1)是一類重要的免疫負性調控分子(也稱“免疫卡控點分子”),通過與細胞表面的程序性死亡受體配體-1(PD-L1)結合,傳遞負性調控信號,抑制免疫細胞的活化。近年,抗PD-1和抗PD-L1抗體已經成為腫瘤免疫治療研究中的熱點。然而,PD-1/PD-L1抗體療效卻深受腫瘤微環(huán)境及腸道菌群的影響。如雙歧桿菌屬菌株或促進PD-1/PD-L1單抗藥物的療效等,然而PD-1/PDL-1在IBD領域研究較少,其是否可以影響腸道菌群對IBD產生作用更不得而知。因此,我們通過構建TNBS誘導的小鼠腸炎模型,利用PD-1抑制劑(G4C2)特異性阻斷PD-1/PD-L1通路,觀察PD-1抑制劑對IBD的作用及對腸道菌群和腸黏膜屏障的影響,為IBD的診治提供一定的實驗數據和理論基礎。方法:臨床研究:采集臨床UC和CD患者及健康志愿者腸粘膜組織,用免疫組化方法檢測PD-L1蛋白的表達量。動物實驗:48只BALB/c小鼠分為正常對照組、TNBS模型組、TNBS+5-ASA組、TNBS+PD-1 inhibitor組。造模當天TNBS模型組、TNBS+5-ASA組、TNBS+PD-1 inhibitor組麻醉后予25mg/ml TNBS乙醇溶液灌腸建模,正常對照組予50%乙醇溶液灌腸。造模24h后每天給藥,TNBS+5-ASA組予5-氨基水楊酸懸液灌胃,TNBS+PD-1 inhibitor組予PD-1抑制劑腹腔注射,正常對照組和TNBS模型組予PBS灌胃;每天記錄小鼠體重、大便性狀和隱血情況計算DAI評分。實驗終點分離測量結腸長度,觀察結腸損傷程度;結腸組織石蠟包埋行HE染色觀察炎癥情況;ELISA檢測血液和腸組織相關細胞因子表達水平;采集實驗終點前小鼠糞便,利用微生物組16s高通量測序分析小鼠糞便菌群的變化;采用麻醉、結扎腸段、FITC-Dextran保留灌腸30min后取血清測熒光強度評估腸壁通透性;組織免疫熒光及免疫組化觀察腸屏障緊密連接蛋白的變化;最后綜合相關指標進行統(tǒng)計學分析。結果:1.臨床IBD患者腸組織PD-L1蛋白表達增高我們通過選取UC、CD和健康志愿者各10例腸黏膜標本,進行免疫組織化學染色檢測PD-L1表達情況,結果發(fā)現(xiàn),和健康志愿者相比,UC患者和CD患者腸黏膜PD-L1蛋白表達增高。2.PD-1抑制劑可能有助于改善TNBS誘導腸炎小鼠一般情況及疾病活動度疾病活動指數(DAI):實驗第7天,TNBS模型組vs正常對照組的DAI積分顯著增加(P0.05),TNBS+5-ASA組、TNBS+PD-1 inhibitor組和正常對照組DAI積分均低于TNBS模型組。結腸大體情況:結腸長度:TNBS模型組vs正常對照組縮短,TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1 inhibitor組vs正常對照組無顯著差異;結腸大體損傷評分:TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1 inhibitor組均小于TNBS模型組。3.PD-1抑制劑可能有助于改善TNBS誘導的小鼠腸炎炎癥水平結腸HE染色:TNBS模型組可見黏膜潰瘍、水腫、增生、大量炎細胞浸潤;TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1 inhibitor組存在不同程度潰瘍,炎細胞浸潤、黏膜增生及水腫,但程度相較TNBS模型組明顯改善。血清TNF-α含量:TNBS模型組血清TNF-α高于正常對照組,TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1 inhibitor組低于TNBS模型組,其中TNBS+PD-1 inhibitor組較TNBS模型組明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其余各組間統(tǒng)計學上未見顯著差異。4.PD-1抑制劑可能有助于改善TNBS誘導的小鼠腸道菌群紊亂,上調菌群多樣性,調整菌群結構,增加產短鏈脂肪酸細菌和粘膜免疫相關細菌豐度1)α多樣性分析:TNBS模型組較正常對照組α多樣性下降趨勢明顯,TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1 inhibitor組較TNBS模型組α多樣性有顯著上升趨勢。2)β多樣性分析:PCA分析和Uni Frac多樣品相似度分析顯示,正常對照組與TNBS模型組腸道菌群結構差異明顯,TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1inhibitor組菌群結構趨近;PD-1 inhibitor干預后TNBS誘導腸炎小鼠腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)豐度上升,變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度下降,該菌群改變與陽性對照組ASA組改變趨勢一致。3)門水平菌群結構變化:PD-1 inhibitor干預后Firmicutes和Deferribacteres門增高,Proteobacteria、Actinobacteria、Tenericutes和Bacteroidetes門減少。綱水平菌群結構變化:PD-1 inhibitor干預后Clostridia綱增加,Bacteroidia、Mollicutes、Erysipelotrichia、Alphaproteobacteria、Bacilli和unidentified Antinobacteria綱減少。目水平菌群結構變化:PD-1 inhibitor干預后Clostridiales目增加,Bacteroidales、Erysipelotrichales、Pseudomonadales、Rhodospirillales、Bifidobacteriales和Mollicutes-RF9目減少�？扑骄航Y構變化:PD-1 inhibitor干預后Rikenellaceae、Lachnospiraceae、Clostridiales-vadin BB60-group、Peptococcaceae和Ruminococcaceae科增加,Christensenellaceae、Prevotellaceae、Aerococcaceae、Rhodospirllaceae、Streptococcaceae、Moraxellaceae、Bacteroidaceae、Family-XII、Clostridiaceae和Erysipelotrichaceae科減少。屬水平菌群結構變化:PD-1 inhibitor干預后Butyricicoccus、Ruminiclostridum、Ruminiclostridum-9、Oscillibacter、Ruminiclostridum-5、Rikenella、Roseburia、Ruminococcaceae、Anaerotruncus和unidentified Lachnospiraceae屬增加,Acinetobacter、Bacteroides、Parabacteroides和Alloprevotella屬減少。種水平菌群結構變化:PD-1 inhibitor干預后Escherichia-coli、Bacteroides acidifaciens、Lachnospiraceae bacterium-COE1和Clostridium leptum菌增加,Acinetobacter baumannii和Bacteroides sartorii菌減少。其中Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Butyricicoccusand Roseburia是腸道共生菌中重要的產短鏈脂肪酸細菌;Bacteroides acidifaciens和Clostridium leptum參與腸粘膜免疫耐受形成。4)Biomarker生物標記物和OTU水平差異種屬:Biomarker生物標記物顯示PD-1 inhibitor能下調TNBS誘導腸炎小鼠菌群中Alloprevotella菌的相對豐度;基于Meta Stat方法分析顯示,PD-1 inhibitor干預后Deferribacteres、Clostridium_sensu_stricto_1、Empedobacter和Mucispirillum菌相對豐度增加。其中Mucispirillum證實與T細胞依賴性Ig A分泌明顯相關。5.PD-1抑制劑一定程度上能改善TNBS誘導的小鼠腸炎屏障缺陷結腸組織切片免疫熒光:TNBS建模后結腸ZO-1表達量下降,經5-ASA和PD-1 inhibitor干預后結腸ZO-1表達上調。免疫組化:TNBS建模后結腸ZO-1和Occludin表達量下降,經5-ASA和PD-1 inhibitor干預后結腸ZO-1和Occludin表達上調血清FITC熒光強度:TNBS模型組血清熒光強度高于正常對照組,TNBS+5-ASA組和TNBS+PD-1 inhibitor組低于TNBS模型組。結論:1.IBD患者腸粘膜PD-L1蛋白表達增高;2.PD-1抑制劑可能有助于緩解TNBS誘導的腸炎小鼠的腸道炎癥及疾病活動度;3.PD-1抑制劑可能有助于改善TNBS誘導的腸炎小鼠的腸道菌群,上調腸道菌群多樣性,調整菌群結構,增加產短鏈脂肪酸細菌和粘膜免疫相關細菌豐度;4.PD-1抑制劑可能有助于改善TNBS誘導的腸炎小鼠的屏障缺陷。
【圖文】：

圖 2 人腸粘膜石蠟切片標本免疫組化（A：健康對照；B：UC 患者；C：CD 患者）2. PD-1 抑制劑可能有助于改善 TNBS 誘導腸炎小鼠一般情況及疾病活動度2.1 小鼠體重變化本實驗于實驗第 2 天行 TNBS 灌腸建模（正常對照組予 50%乙醇溶液灌腸對照），建模前禁食 24h，故各組小鼠體重下降，實驗第 3 天至實驗終點，TNBS組體重持續(xù)下降，正常對照組體重未見明顯改變，TNBS+5-ASA 組和 TNBS+PD-1inhibitor 組體重平緩上升，實驗終點時，，正常對照組、TNBS+5-ASA 組和 TNBS+PD-1 inhibitor 組三組體重未見明顯差異；TNBS 組體重明顯低于另外三組體重，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示 PD-1 inhibitor 可以緩解 TNBS 造成小鼠的體重下降。（表 5，圖 3）。

圖 3 小鼠體重曲線（g）.2 小鼠疾病活動度系數（DAI）建模后 TNBS 組 DAI 積分均高于正常對照組， 建模第 5 天，TNBS 組NBS+5-ASA 組和 TNBS+ PD-1 inhibitor 組 DAI 積分均高于正常對照組，具計學差異（P＜0.05），但根據各組均數及標準差數據，TNBS+ PD-1 inhib和 TNBS+5-ASA 組 DAI 積分從建模 2 天后開始，均低于 TNBS 組，具有統(tǒng)差異（P＜0.05），且 PD-1 inhibitor 干預后 DAI 積分下降趨勢比于 5-ASA更明顯。（表 6，圖 4）
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 錢家鳴;楊紅;;中國炎癥性腸病研究的歷史回顧 現(xiàn)狀和展望[J];中國實用內科雜志;2015年09期

2 陳淑增;白劍鵬;謝永華;游玉權;蘇密龍;許秀秀;李振喜;;強直性脊柱炎患者外周血Th17、Treg、Th1免疫失衡及其與疾病活動相關性研究[J];中國免疫學雜志;2013年08期

本文編號：2624661