【摘要】： 在1999年9月份,當一個正在通過肝動脈給藥,接受高滴度腺病毒載體治療的病人死于病毒載體所引發(fā)的毒性反應后,人們對于腺病毒(Ad)載體用于臨床基因治療的理解發(fā)生了轉變。當然,在臨床治療中所需的對腺病毒載體的連續(xù)性給藥可能關系到機體對腺病毒的強烈反應,但是更重要的是,通過研究人們獲得了更多的對腺病毒毒性的了解。我們都意識到,沒有哪一種載體系統(tǒng)是完美無缺的。在看到腺病毒載體并不適于所有治療應用的同時,我們也不會因此而忽略腺病毒載體那些相對于其他載體系統(tǒng)的顯著優(yōu)點:能夠有效地感染靜息或分裂中細胞,這是很多載體無法做到的;腺病毒能夠在短時間內實現(xiàn)高水平的基因表達,這對于那些只需要短期高表達轉基因就能產生足夠治療效應的應用意義重大。腺病毒載體潛在應用包括治療性的血管生成作用,能夠在中央神經系統(tǒng)(CNS)實施感染,以及在那些腺病毒的毒副作用也能產生幫助的治療當中如作為腫瘤疫苗。當然毫無疑問的是,為了更廣泛地應用腺病毒載體,解決其引起體內免疫應答的問題是當務之急。本次研究集中在腺病毒誘導的肝臟損傷,誘導體內肝臟抗病毒免疫抑制和黑色素瘤基因治療方面,獲得了如下的結果: 1、新型高壓注射重組腺病毒誘導肝損傷模型的建立 目前,腺病毒載體能在肝臟中定位并引起肝臟炎癥和損傷的研究甚多,但是通用的動物模型研究并不多。本部分研究的目的就是建立一種新的腺病毒誘導的爆發(fā)性肝炎模型,來促進對腺病毒誘導的自身免疫性肝炎的機制研究。我們采用了高壓注射(注射體積占體重10%,并在7秒中內完成注射)腺病毒載體的方法,將腺病毒載體快速地特異地通過尾靜脈傳遞到小鼠肝臟內部,觀察后繼的病毒感染引起的肝臟損傷。C57 BL/6小鼠尾靜脈高壓注射表達不同產物的腺病毒(AdLacZ,AdEGFP,AdsiNeg),通過流式細胞術分析肝臟內部淋巴細胞的比例和絕對數(shù),血清轉氨酶和HE染色被用作評價肝臟損傷的指標。我們發(fā)現(xiàn),高壓注射腺病毒比普通注射誘導更加嚴重的肝臟炎癥:大量的單個核細胞迅速浸潤,尤其是肝臟NK細胞顯著增加和活化;同時發(fā)現(xiàn)血清ALT轉氨酶水平大幅升高:肝臟內出現(xiàn)多處壞死;IFN-γ在肝臟中的轉錄水平及在血清中蛋白水平上升。通過注射抗體預先清除NK細胞,可以顯著減輕腺病毒誘導的肝臟損傷以及炎癥因子IFN-γ的表達水平。這些數(shù)據(jù)表明腺病毒感染誘導了肝臟中NK細胞的浸潤和活化,從而導致了肝細胞的損傷以及肝臟炎癥的產生,NK細胞是該模型中病毒感染引發(fā)的早期炎癥的主要效應細胞。總的來說,我們的工作展示了一個與人的急性肝臟感染相關的新的病毒肝炎模型,為研究腺病毒提供了一個實用有效的工具和平臺。 2、治療性RNA干擾CX3CL1抑制腺病毒引起的肝臟損傷 我們研究了趨化因子CX3CL1/fractalkine(FKN)在抗病毒感染免疫應答中的作用。FKN是一種CX3C類的趨化因子,有膜結合型和分泌型兩種存在形式。大部分NK細胞,CD14~-單核細胞及部分的CD8~+T細胞表達相應受體CX3CR1。通過進一步研究以上構建的高壓注射腺病毒誘導的肝臟損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)CX3CL1在腺病毒感染的肝臟中是顯著上調的,并且有意思的是同時發(fā)現(xiàn)浸潤到炎癥肝臟中的主要效應細胞NK細胞上相應受體的CX3CR1表達也顯著上調。為了進一步證明二者關系,我們構建了表達重組小鼠CX3CL1的腺病毒進行注射,發(fā)現(xiàn)在肝臟內過表達CX3CL1大大增加了CX3CR1~+NK細胞的浸潤和活化水平,血清中ALT轉氨酶的水平及肝臟壞死程度也大幅升高。這表明腺病毒感染肝臟后誘導肝臟內CX3CL1的表達增加,CX3CL1與其受體CX3CR1相互作用在NK細胞的招募和活化以及IFN-γ的產生中行使重要的作用。因此,抑制CX3CL1的表達將可作為抗腺病毒炎癥治療的一個選擇。實驗中,運用高壓注射表達CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒進行了體內RNA干擾,發(fā)現(xiàn)病毒感染后CX3CL1在肝臟中的表達水平被明顯抑制,相應地,NK細胞的浸潤及肝臟損傷和炎癥也顯著下調。為了更好地驗證CX3CL1的促炎癥作用,我們在注射腺病毒之前用CX3CL1或CX3CR1的阻斷抗體預先處理小鼠,結果顯示肝臟中的炎癥損傷及淋巴細胞浸潤也能被很好地抑制。綜上,該實驗證明了CX3CL1-CX3CR1趨化因子系統(tǒng)在腺病毒誘導的肝臟損傷中的促炎癥功能和重要性,并為體內基因治療提供了一個新的靶點和手段。 3、RNA干擾CX3CL1抑制黑色素瘤體內生長及機制研究 雖然有報道稱過表達的CX3CL1促進對腫瘤細胞的殺傷,CX3CL1行使的是抑制腫瘤生長的作用。而我們的研究經RT-PCR,Western Blotting以及免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素瘤B16-F0細胞及一些腫瘤病人的實體瘤表達CX3CL1。進一步的流式細胞術抗體檢測發(fā)現(xiàn)B16上CX3CL1為陽性,而ELISA檢測發(fā)現(xiàn)B16的培養(yǎng)上清中無可溶性FKN的表達,這證明了B16表達的CX3CL1為膜結合型。因此我們猜測這種膜結合型的CX3CL1可能參與了腫瘤的發(fā)生過程。運用表達CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒感染B16-F0黑色素瘤細胞,沉默了B16細胞上CX3CL1的表達。通過流式細胞分選技術篩選得到CX3CL1表達被有效抑制的B16細胞。在C57 BL/6小鼠上進行體內荷瘤的結果發(fā)現(xiàn)CX3CL1敲除鼠與對照組相比腫瘤的成瘤性大幅降低;生存曲線數(shù)據(jù)表明CX3CL1敲除組的小鼠的生存情況要顯著優(yōu)于對照組。對腫瘤切片加以研究發(fā)現(xiàn),血管內皮細胞表達CX3CL1的受體CX3CR1;CX3CL1敲除組的腫瘤生長受到嚴重抑制且瘤體內部和周圍只有少量的血管生成,而對照組腫瘤生長旺盛,并伴隨著大量的腫瘤內血管分布。因此我們有理由認為腫瘤表達一定水平的CX3CL1來促進它們自身與體內表達CX3CR1的血管內皮細胞相互作用,加強腫瘤發(fā)生過程中對血管內皮的黏附及促腫瘤內部血管生成,從而促進了腫瘤的發(fā)生。
【圖文】：

中國科學技術大學博士學位論文第一章文獻綜述載體的應用及其限制性病毒載體簡介病毒料(Adenoviridae)。根據(jù)宿主范圍不astadenoviruS)和禽類腺病毒(Aviadenov雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少l的余種血清型，其中人腺病毒有5帥扣，分治療常用的人2型及5型，血清學分類上均構形態(tài)叭俏叨咋.nobel.se

毒DNA復制模型示意圖(引自TheBtoto舒of片ruse，Bruc毒載體的發(fā)展階段大多以5型(Ads)、2型(Ad2)為基礎，共有3代因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體，此類型基因，去除區(qū)蛋白的功能由反式提供El區(qū)表達蛋白的有293，911，N52.E6和PER.C6。第l代Ady的生產毒基因組整合于細胞染色體外，可以避免插入誘變的不能在活體內復制，但由于許多感受態(tài)細胞都含有允白，即使表達量很低，仍可增強病毒DNA復制、晚期毒(replieationeompetentadenovirus，RCA)的產生，引疫應答，激活細胞毒性T淋巴細胞的免疫反應，最終
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R512.6;R730.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 柳云帆;吳小兵;阮力;;腺病毒載體在疫苗研究中的應用[J];生物技術通訊;2011年04期

2 盧建溪;陽莉;錢師宇;王強;;攜帶紅色熒光蛋白報告基因的重組腺病毒載體的構建[J];中國微生態(tài)學雜志;2011年08期

3 徐遠玲;張旭東;馬宏寶;;腺病毒載體左側反向末端重復區(qū)對下游基因表達特異性的影響[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2011年04期

4 林茂海;蘇津自;蔡文欽;鄭禮裕;許昌聲;王華軍;;攜帶腎上腺髓質素基因腺病毒體外轉染骨髓間充質干細胞及其蛋白的表達[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年23期

5 林峰;苗北平;盧永田;;重組adv5.oriP.HRP腺病毒載體構建及對EBV陽性鼻咽癌C666-1細胞株的靶向表達[J];數(shù)理醫(yī)藥學雜志;2011年03期

6 冷加燕;許文林;沈慧玲;龍璐璐;吳曉君;陳巧云;姚俊;;YB-1腺病毒載體的構建及其對乳腺癌MCF-7細胞耐藥性的影響[J];江蘇大學學報(醫(yī)學版);2011年04期

7 王滎;王延洲;徐惠成;;deltex-1腺病毒載體的構建及其在大鼠bMSCs中的表達[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年15期

8 應希;王一;;αA晶狀體蛋白重組腺病毒載體的構建和鑒定[J];眼科新進展;2011年09期

9 孟希亭;林晨;梅佳;王海娟;馬飛;張金龍;張穎;錢海利;;活體成像系統(tǒng)檢測攜熒光素酶增殖缺陷型腺病毒在小鼠體內的表達和分布[J];中國腫瘤生物治療雜志;2011年04期

10 鐘聲;劉丹平;劉素偉;李曉禹;李諶;李媛;;血管內皮生長因子121和骨形態(tài)蛋白2雙基因共表達重組腺病毒載體的構建及鑒定[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年20期

相關會議論文 前10條

1 王晉慧;姚明忠;顧錦法;孫蘭英;郎明非;劉菁;劉新垣;;腫瘤靶向性腺病毒載體的構建[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術會議論文摘要集[C];2001年

2 劉旭;田長富;;癌基因治療中的腺病毒載體的開發(fā)和應用(綜述Ⅱ)[A];慶祝黑龍江省免疫學會成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

3 凌昌全;李紹祥;張晨;張亞妮;;攜蜂毒素基因腺病毒載體的構建及體外抑瘤實驗研究[A];第九屆全國中西醫(yī)結合腫瘤學術研討會論文集[C];2002年

4 馬立新;馬琪;徐松;;新型、簡捷、有效的方法構建基于腺病毒載體系統(tǒng)的cDNA表達文庫[A];中國蛋白質組學首屆學術大會論文摘要集[C];2003年

5 王桂蘭;魯繼榮;成煥吉;馬青山;張云峰;;高滴度含有目的基因IL-4RA的逆轉錄病毒的包裝和濃縮[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

6 吳運譜;張曉華;喬傳玲;;腺病毒載體流感疫苗研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會第三次學術研討會論文集[C];2012年

7 劉金娟;馬翔;;小鼠HSP27基因腺病毒表達載體的構建與鑒定[A];第四屆長三角婦產科學術論壇暨浙江省2009年婦產科學術年會論文匯編[C];2009年

8 劉瀟聰;陳耀凱;;腺病毒體外介導CTLA4-Ig在L02細胞中的表達及其生物學活性[A];全國第3屆中西醫(yī)結合傳染病學術會議暨中國中西醫(yī)結合學會傳染病專業(yè)委員會第2屆委員會議論文匯編[C];2010年

9 張春燕;李方和;龔勁松;陳妍;;抗腺病毒載體單克隆抗體的制備及其初步鑒定[A];中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議論文摘要[C];2006年

10 張子陽;袁春玉;楊亦彬;;人促血管生成素1腺病毒載體的構建[A];貴州省醫(yī)學會腎臟病學分會2008年學術年會論文匯編[C];2008年

相關重要報紙文章 前10條

1 記者 李天舒　通訊員 朱丹萍;一研究證實腺病毒載體依然是安全的[N];健康報;2011年

2 本報記者 劉松柏;基因治療的探路者[N];經濟日報;2010年

3 火言;疫苗研發(fā)全球賽跑[N];中國質量報;2003年

4 萬同己;P53基因與腫瘤基因治療[N];中國醫(yī)藥報;2004年

5 麥迪信;糖尿病基因療法初見成效[N];醫(yī)藥經濟報;2003年

6 加聞;加拿大非典疫苗研究獲新進展[N];醫(yī)藥經濟報;2003年

7 翁維良：中國中醫(yī)研究院首席研究員，中國中西醫(yī)結合學會活血化瘀學會副主任委員，內科主任醫(yī)師，博士生導師;心血管病基因療法[N];中國中醫(yī)藥報;2000年

8 記者 毛磊;肌營養(yǎng)不良基因法可療[N];新華每日電訊;2002年

9 王俊鳴;接種疫苗的猴子產生免疫反應[N];科技日報;2003年

10 記者 王雪飛;支架+轉基因可減少心臟介入術后血管再狹窄[N];健康報;2000年

相關博士學位論文 前10條

1 陳清烽;靶向CX3CL1的RNA干擾在病毒性肝炎及癌癥中的治療作用[D];中國科學技術大學;2008年

2 扈江偉;腺病毒介導hTRX修飾的間充質干細胞在小鼠急性放射損傷中的修復作用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2012年

3 張燕玲;腦源性神經生長因子前體ProBDNF在大鼠后足切割痛的作用及可能機制研究[D];中南大學;2012年

4 吳成君;Ad35腺病毒載體構建及病毒蛋白免疫原性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2009年

5 于彬;六鄰體嵌合型重組5型腺病毒載體逃避預存免疫的研究[D];吉林大學;2012年

6 席啟林;維生素D受體調控尿鈣重吸收的分子機制研究[D];華中科技大學;2010年

7 徐尤年;血管生成素1腺病毒載體的構建及其對內毒素性肺損傷炎癥消退的影響[D];華中科技大學;2010年

8 陳劍;BMP2和BMP7基因共轉染兔骨髓間充質干細胞構建組織工程骨的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

9 王鵬;表達His-tag-ICP47融合基因腺病毒載體的構建及其免疫活性的研究[D];鄭州大學;2011年

10 刁彥鵬;腺病毒載體介導轉染CD基因抑制大鼠移植靜脈內膜增生及其機制的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學;2005年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳媛媛;hIL-12腺病毒載體的構建及在人hBMSCs中的表達[D];山西醫(yī)科大學;2010年

2 宋默;攜帶p53基因和Flt3L配體基因的腺病毒載體的構建及鑒定[D];大連醫(yī)科大學;2010年

3 宋付凱;高表達hRAMP1基因腺病毒載體的構建及其在兔MSCs中表達的實驗研究[D];遵義醫(yī)學院;2010年

4 劉海斌;腺病毒介導的mda-7/IL-24基因對人喉癌細胞Hep-2的凋亡作用[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

5 魏菁;腺病毒介導ChM-I基因抑制BMSCs體內構建的軟骨血管化的實驗研究[D];西北大學;2010年

6 劉海平;非增殖性腺病毒攜帶全長抗體Cetuximab的腫瘤基因治療的研究[D];浙江理工大學;2010年

7 蘇秀云;應用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構建攜帶人骨形成蛋白2基因的重組腺病毒[D];第一軍醫(yī)大學;2005年

8 毛亮;選擇增殖型腺病毒ZD55攜帶自殺基因Dm-dNK(果蠅脫氧核糖核苷酸激酶）治療大腸癌的研究[D];中國醫(yī)科大學;2010年

9 王曉剛;人白細胞介素23基因克隆和攜帶EGFP腺病毒載體的構建與鑒定[D];大連醫(yī)科大學;2007年

10 陳童;構建降鈣素基因相關肽的穿梭載體[D];浙江大學;2007年

，

本文編號：2624231