【摘要】： 在1999年9月份,當(dāng)一個(gè)正在通過(guò)肝動(dòng)脈給藥,接受高滴度腺病毒載體治療的病人死于病毒載體所引發(fā)的毒性反應(yīng)后,人們對(duì)于腺病毒(Ad)載體用于臨床基因治療的理解發(fā)生了轉(zhuǎn)變。當(dāng)然,在臨床治療中所需的對(duì)腺病毒載體的連續(xù)性給藥可能關(guān)系到機(jī)體對(duì)腺病毒的強(qiáng)烈反應(yīng),但是更重要的是,通過(guò)研究人們獲得了更多的對(duì)腺病毒毒性的了解。我們都意識(shí)到,沒(méi)有哪一種載體系統(tǒng)是完美無(wú)缺的。在看到腺病毒載體并不適于所有治療應(yīng)用的同時(shí),我們也不會(huì)因此而忽略腺病毒載體那些相對(duì)于其他載體系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn):能夠有效地感染靜息或分裂中細(xì)胞,這是很多載體無(wú)法做到的;腺病毒能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高水平的基因表達(dá),這對(duì)于那些只需要短期高表達(dá)轉(zhuǎn)基因就能產(chǎn)生足夠治療效應(yīng)的應(yīng)用意義重大。腺病毒載體潛在應(yīng)用包括治療性的血管生成作用,能夠在中央神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)實(shí)施感染,以及在那些腺病毒的毒副作用也能產(chǎn)生幫助的治療當(dāng)中如作為腫瘤疫苗。當(dāng)然毫無(wú)疑問(wèn)的是,為了更廣泛地應(yīng)用腺病毒載體,解決其引起體內(nèi)免疫應(yīng)答的問(wèn)題是當(dāng)務(wù)之急。本次研究集中在腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷,誘導(dǎo)體內(nèi)肝臟抗病毒免疫抑制和黑色素瘤基因治療方面,獲得了如下的結(jié)果: 1、新型高壓注射重組腺病毒誘導(dǎo)肝損傷模型的建立 目前,腺病毒載體能在肝臟中定位并引起肝臟炎癥和損傷的研究甚多,但是通用的動(dòng)物模型研究并不多。本部分研究的目的就是建立一種新的腺病毒誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝炎模型,來(lái)促進(jìn)對(duì)腺病毒誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎的機(jī)制研究。我們采用了高壓注射(注射體積占體重10%,并在7秒中內(nèi)完成注射)腺病毒載體的方法,將腺病毒載體快速地特異地通過(guò)尾靜脈傳遞到小鼠肝臟內(nèi)部,觀察后繼的病毒感染引起的肝臟損傷。C57 BL/6小鼠尾靜脈高壓注射表達(dá)不同產(chǎn)物的腺病毒(AdLacZ,AdEGFP,AdsiNeg),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析肝臟內(nèi)部淋巴細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù),血清轉(zhuǎn)氨酶和HE染色被用作評(píng)價(jià)肝臟損傷的指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn),高壓注射腺病毒比普通注射誘導(dǎo)更加嚴(yán)重的肝臟炎癥:大量的單個(gè)核細(xì)胞迅速浸潤(rùn),尤其是肝臟NK細(xì)胞顯著增加和活化;同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清ALT轉(zhuǎn)氨酶水平大幅升高:肝臟內(nèi)出現(xiàn)多處壞死;IFN-γ在肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平及在血清中蛋白水平上升。通過(guò)注射抗體預(yù)先清除NK細(xì)胞,可以顯著減輕腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷以及炎癥因子IFN-γ的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明腺病毒感染誘導(dǎo)了肝臟中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化,從而導(dǎo)致了肝細(xì)胞的損傷以及肝臟炎癥的產(chǎn)生,NK細(xì)胞是該模型中病毒感染引發(fā)的早期炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞�？偟膩�(lái)說(shuō),我們的工作展示了一個(gè)與人的急性肝臟感染相關(guān)的新的病毒肝炎模型,為研究腺病毒提供了一個(gè)實(shí)用有效的工具和平臺(tái)。 2、治療性RNA干擾CX3CL1抑制腺病毒引起的肝臟損傷 我們研究了趨化因子CX3CL1/fractalkine(FKN)在抗病毒感染免疫應(yīng)答中的作用。FKN是一種CX3C類(lèi)的趨化因子,有膜結(jié)合型和分泌型兩種存在形式。大部分NK細(xì)胞,CD14~-單核細(xì)胞及部分的CD8~+T細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)受體CX3CR1。通過(guò)進(jìn)一步研究以上構(gòu)建的高壓注射腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)CX3CL1在腺病毒感染的肝臟中是顯著上調(diào)的,并且有意思的是同時(shí)發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)到炎癥肝臟中的主要效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞上相應(yīng)受體的CX3CR1表達(dá)也顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步證明二者關(guān)系,我們構(gòu)建了表達(dá)重組小鼠CX3CL1的腺病毒進(jìn)行注射,發(fā)現(xiàn)在肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)CX3CL1大大增加了CX3CR1~+NK細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化水平,血清中ALT轉(zhuǎn)氨酶的水平及肝臟壞死程度也大幅升高。這表明腺病毒感染肝臟后誘導(dǎo)肝臟內(nèi)CX3CL1的表達(dá)增加,CX3CL1與其受體CX3CR1相互作用在NK細(xì)胞的招募和活化以及IFN-γ的產(chǎn)生中行使重要的作用。因此,抑制CX3CL1的表達(dá)將可作為抗腺病毒炎癥治療的一個(gè)選擇。實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)用高壓注射表達(dá)CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒進(jìn)行了體內(nèi)RNA干擾,發(fā)現(xiàn)病毒感染后CX3CL1在肝臟中的表達(dá)水平被明顯抑制,相應(yīng)地,NK細(xì)胞的浸潤(rùn)及肝臟損傷和炎癥也顯著下調(diào)。為了更好地驗(yàn)證CX3CL1的促炎癥作用,我們?cè)谧⑸湎俨《局坝肅X3CL1或CX3CR1的阻斷抗體預(yù)先處理小鼠,結(jié)果顯示肝臟中的炎癥損傷及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)也能被很好地抑制。綜上,該實(shí)驗(yàn)證明了CX3CL1-CX3CR1趨化因子系統(tǒng)在腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷中的促炎癥功能和重要性,并為體內(nèi)基因治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)和手段。 3、RNA干擾CX3CL1抑制黑色素瘤體內(nèi)生長(zhǎng)及機(jī)制研究 雖然有報(bào)道稱(chēng)過(guò)表達(dá)的CX3CL1促進(jìn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷,CX3CL1行使的是抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。而我們的研究經(jīng)RT-PCR,Western Blotting以及免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素瘤B16-F0細(xì)胞及一些腫瘤病人的實(shí)體瘤表達(dá)CX3CL1。進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B16上CX3CL1為陽(yáng)性,而ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B16的培養(yǎng)上清中無(wú)可溶性FKN的表達(dá),這證明了B16表達(dá)的CX3CL1為膜結(jié)合型。因此我們猜測(cè)這種膜結(jié)合型的CX3CL1可能參與了腫瘤的發(fā)生過(guò)程。運(yùn)用表達(dá)CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒感染B16-F0黑色素瘤細(xì)胞,沉默了B16細(xì)胞上CX3CL1的表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選得到CX3CL1表達(dá)被有效抑制的B16細(xì)胞。在C57 BL/6小鼠上進(jìn)行體內(nèi)荷瘤的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CX3CL1敲除鼠與對(duì)照組相比腫瘤的成瘤性大幅降低;生存曲線數(shù)據(jù)表明CX3CL1敲除組的小鼠的生存情況要顯著優(yōu)于對(duì)照組。對(duì)腫瘤切片加以研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CX3CL1的受體CX3CR1;CX3CL1敲除組的腫瘤生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制且瘤體內(nèi)部和周?chē)挥猩倭康难苌?而對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)旺盛,并伴隨著大量的腫瘤內(nèi)血管分布。因此我們有理由認(rèn)為腫瘤表達(dá)一定水平的CX3CL1來(lái)促進(jìn)它們自身與體內(nèi)表達(dá)CX3CR1的血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用,加強(qiáng)腫瘤發(fā)生過(guò)程中對(duì)血管內(nèi)皮的黏附及促腫瘤內(nèi)部血管生成,從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。
【圖文】：

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述載體的應(yīng)用及其限制性病毒載體簡(jiǎn)介病毒料(Adenoviridae)。根據(jù)宿主范圍不astadenoviruS)和禽類(lèi)腺病毒(Aviadenov雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少l的余種血清型，其中人腺病毒有5帥扣，分治療常用的人2型及5型，血清學(xué)分類(lèi)上均構(gòu)形態(tài)叭俏叨咋.nobel.se

毒DNA復(fù)制模型示意圖(引自TheBtoto舒of片ruse，Bruc毒載體的發(fā)展階段大多以5型(Ads)、2型(Ad2)為基礎(chǔ)，共有3代因缺失的腺病毒載體稱(chēng)為第一代腺病毒載體，此類(lèi)型基因，去除區(qū)蛋白的功能由反式提供El區(qū)表達(dá)蛋白的有293，911，N52.E6和PER.C6。第l代Ady的生產(chǎn)毒基因組整合于細(xì)胞染色體外，可以避免插入誘變的不能在活體內(nèi)復(fù)制，但由于許多感受態(tài)細(xì)胞都含有允白，即使表達(dá)量很低，仍可增強(qiáng)病毒DNA復(fù)制、晚期毒(replieationeompetentadenovirus，RCA)的產(chǎn)生，引疫應(yīng)答，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，最終
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R512.6;R730.5

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本文編號(hào)：2624231