【摘要】：第一部分健康人外周血樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定 目的： 建立外周血樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)體外培養(yǎng)方法 方法： 無菌條件下取健康人新鮮外周血20ml,提取(密度梯度離心法)單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),取貼壁細(xì)胞完全培養(yǎng)基中(含重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1000U/ml、重組人白細(xì)胞介素4(rhlL-4)500U/ml、重組人腫瘤壞死因子α[(rhTNF-a)20ng/ml誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs,倒置顯微鏡下觀察基體外培養(yǎng)過程中形態(tài)特征,在透射電鏡下分析DCs細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),使用流式細(xì)胞儀對(duì)DCs進(jìn)行鑒定并檢測(cè)其表型分子的表達(dá)。 結(jié)果： 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)體系從外周血PBMCs可誘導(dǎo)DCs生成量為每20m1約(1.3～3.6×106),透射電鏡證實(shí)呈典型的DCs細(xì)胞形態(tài)學(xué),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs的表型分子,并且用ELISA試劑盒檢測(cè)DCs上清液中IFN-α、IL-4的分泌水平。DCs的表達(dá)分別為FITC-CD1α44.57±3.12%.PE-HLA-DR90.45±4.37％、FITC-CD8078.92±2.18%.PE-CD8677.02±1.93%,FITC-CD8340.29±4.17%；IFN-α.IL-4分泌水平為28.56±8.31.37.77±10.28. 結(jié)論： 利用rhGM-CSF和rhIL-4、rhIFN-α可以從外周血中擴(kuò)增出大量DCs,為DCs的研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 第二部分健康人外周血T淋巴細(xì)胞的分離提取 目的： 建立T淋巴細(xì)胞體外分離與提取的方法 方法： 取新鮮健康人血,經(jīng)密度梯度離心法獲得分離后的單個(gè)核細(xì)胞后移至37℃、5%C02培養(yǎng)箱孵育過夜。取上清液在其中加入T細(xì)胞尼龍毛柱,在5%C02培養(yǎng)箱中撫育1h,PBS沖洗后得到T淋巴細(xì)胞。 結(jié)果： 收集的淋巴細(xì)胞,直接用PE標(biāo)記的鼠抗人CD3和CD8、FITC標(biāo)記的CD4標(biāo)記后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示,正常人CD3+、CD4+和CD8+、CD4/CD8的表達(dá)水平分別70.92士1.77%、42.95±2.01%、24.24±1.35%、1.78±0.07%。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)對(duì)T淋巴細(xì)胞的形態(tài)、表現(xiàn)進(jìn)行初步觀察和分析,為進(jìn)一步開展對(duì)T淋巴細(xì)胞的深入研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 第三部分HBV相關(guān)性肝衰竭黃疸癥陰黃、陽(yáng)黃證與外周血免疫細(xì)胞功能研究 目的： 本實(shí)驗(yàn)通過觀察HBV相關(guān)性肝衰竭(本文以下簡(jiǎn)稱肝衰竭)黃疸癥患者陰黃證、陽(yáng)黃證外周血樹突狀細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的功能,了解肝衰竭黃疸癥陰黃證、陽(yáng)黃證兩癥型的免疫表達(dá)的特點(diǎn)。 方法： 本研究納入肝衰竭黃疸癥患者,分為陽(yáng)黃組與陰黃組兩組,另設(shè)一組健康對(duì)照組,以外周血來源的PBMCs體外分離誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs與T淋巴細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)DCs的表面分子HLA-DR、CD80、 CD86、CD83、CD1α,以及T細(xì)胞表面分子CD3、CD4與CD8,并檢測(cè)DCs的上清液中IFN-α、IL-4的分泌水平,觀察比較肝衰竭患者陰、陽(yáng)黃證與免疫細(xì)胞及炎癥因子表達(dá)的差異。 結(jié)果： 1.肝衰竭組與健康組比較,其DCs表面分子HLA-DR、CD1α、CD83、 CD80.CD86表達(dá)率降低；T細(xì)胞表面分子CD3.CD4表達(dá)及CD4/CD8比值降低,CD8表達(dá)上升,DCs分泌因子IFN-α、表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或0.01)。 2.陽(yáng)黃組與健康組比較,其DCs表面分子HLA-DR、CD1α、CD83、 CD80、CD86表達(dá)率降低；T細(xì)胞表面分子CD3、CD4表達(dá)及CD4/CD8比值降低,CD8表達(dá)上升；DCs分泌因子IFN-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或0.01),IL-4無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.陰黃組與健康組比較,其DCs表面分子HLA-DR、CD1α、CD83、 CD80、CD86表達(dá)率降低；T細(xì)胞表面分子CD3、CD4表達(dá)及CD4/CD8比值降低,CD8表達(dá)上升；DCs分泌因子IFN-α、 IL-4表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或0.01) 4.肝衰竭患者陽(yáng)黃組、陰黃組之間DCs表面分子HLA-DR、 CD1α、 CD80及TCs表面分子CD3、CD4之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陰黃組與陽(yáng)黃組比較,DCs表面分子CD83、CD86及TCs的CD4/CD8比值低于陽(yáng)黃組,TCs表面分子CD8上升,DCs分泌因子IFN-α表達(dá)降低,IL-4表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論： 1.HBV相關(guān)性肝衰竭患者的DCs、TCs的功能狀態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下,及炎癥因子IFN-α的增高。 2.陽(yáng)黃證患者的DCs、TCs的功能狀態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下,及炎癥因子IFN-α的增高。 3.陰黃證患者的DCs、TCs的功能狀態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下,炎癥因子IFN-α、抗炎癥因子IL-4同時(shí)存在增高。 4.陽(yáng)黃證、陰黃證患者的DCs、TCs的功能狀態(tài)比較,說明陰黃證患者的細(xì)胞免疫功能更為低下,陰黃證患者同時(shí)存在炎癥因子IFN-α及抗炎癥因子IL-4的增高。
【圖文】：

2. DCs電鏡下的形態(tài)特征收集培養(yǎng)9天的DCs,制成透射電鏡標(biāo)本觀察，可見細(xì)胞體積比較大，，多成不規(guī)則圓形或梭形，細(xì)胞表面突起比較豐富，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，線粒體結(jié)構(gòu)較清楚，溶酶體豐富，核大而圓，核膜較清晰，染色質(zhì)分布較均勾。鑒定結(jié)果如圖所示：

2. DCs電鏡下的形態(tài)特征收集培養(yǎng)9天的DCs,制成透射電鏡標(biāo)本觀察，可見細(xì)胞體積比較大，多成不規(guī)則圓形或梭形，細(xì)胞表面突起比較豐富，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，線粒體結(jié)構(gòu)較清楚，溶酶體豐富，核大而圓，核膜較清晰，染色質(zhì)分布較均勾。鑒定結(jié)果如圖所示：
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R575.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2622741