【摘要】：目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD),目前世界上最常見的慢性肝病,是以肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積為主要特征的代謝應(yīng)激性肝損傷。脂噬,是細(xì)胞內(nèi)選擇性識(shí)別并降解脂質(zhì)、產(chǎn)生游離脂肪酸、促進(jìn)β氧化的自噬過程,是調(diào)控脂質(zhì)代謝、防止脂質(zhì)過度沉積的重要進(jìn)程。抑制自噬削弱了肝內(nèi)脂質(zhì)降解,可顯著增加肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量,促進(jìn)了肝臟脂肪變性的發(fā)生和發(fā)展。人類白細(xì)胞分化抗原36(cluster of differentiation 36,CD36),又稱脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,FAT),是一種長(zhǎng)鏈脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白,參與脂質(zhì)代謝;CD36也具有重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)作用,參與了脂肪酸儲(chǔ)存和利用、糖代謝以及代謝性炎癥等。近年來研究發(fā)現(xiàn),CD36可通過AMPK信號(hào)通路影響脂肪酸β氧化,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。然而,CD36與脂噬的關(guān)系未見報(bào)道。因此,本課題旨在探討CD36是否調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂噬從而影響NAFLD的發(fā)展及可能的分子機(jī)制。方法:采用體重相近的6-8周齡C57BL/6J雄性小鼠,隨機(jī)分組為普通飲食(normal chow diet,NCD)組和高脂飲食(high-fat diet,HFD)組,每組六只,分別用正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)14周,構(gòu)建NAFLD小鼠模型。采用蘇木精-伊紅(haematoxylineosin,HE)染色,并檢測(cè)肝臟組織內(nèi)甘油三酯和游離脂肪酸含量。用western blotting法檢測(cè)肝臟組織CD36、LC3Ⅱ、p62的蛋白表達(dá)水平。分別轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)于HepG2和Huh7細(xì)胞中以敲降CD36表達(dá)或用慢病毒構(gòu)建CD36過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系,western blotting、單丹磺酰尸胺(MDC)染色和免疫熒光法觀察CD36表達(dá)改變后的自噬水平。自噬抑制劑氯喹處理肝細(xì)胞或轉(zhuǎn)染自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)后,檢測(cè)CD36表達(dá)對(duì)自噬流的影響。采用6-8周齡C57BL/6J背景的野生型(wild type,WT)小鼠和CD36基因敲除(CD36 knockout,CD36-/-)小鼠,分別隨機(jī)分組為NCD組和HFD組,每組六只,分別用正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)14周,檢測(cè)肝臟組織自噬。采用6-8周齡CD36-/-小鼠,分別經(jīng)尾靜脈注射GV341慢病毒空載體或攜帶CD36基因的GV341慢病毒,且保持高脂飲食喂養(yǎng)8周后,用透射電子顯微鏡觀察肝臟組織自噬囊泡的變化。沉默CD36后,采用LC3蛋白或溶酶體與脂滴共定位的方法觀察肝細(xì)胞脂噬的變化,酶法檢測(cè)甘油三酯含量,線粒體壓力測(cè)試試驗(yàn)檢測(cè)氧耗速率,并用western blotting法和定量PCR(qPCR)法檢測(cè)肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1a,CPT1a)的表達(dá)。western blotting法檢測(cè)肝細(xì)胞和肝組織內(nèi)CD36表達(dá)下調(diào)后AMPK激活的變化,用AMPK抑制劑Compound C處理后檢測(cè)肝細(xì)胞自噬的改變,bodipy染色觀察脂質(zhì)含量的變化。qPCR篩選主要自噬相關(guān)基因,western blotting法檢測(cè)ULK1、Beclin1總蛋白及磷酸化水平。結(jié)果:與NCD組相比,HFD組小鼠肝臟脂肪變性明顯,肝組織甘油三酯和游離脂肪酸含量明顯升高。HFD組小鼠肝臟組織CD36表達(dá)明顯升高,LC3Ⅱ表達(dá)下降,p62表達(dá)升高。在HepG2和Huh7細(xì)胞中,敲降CD36表達(dá)后自噬升高;而過表達(dá)CD36后自噬下降。通過氯喹處理細(xì)胞和自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),證實(shí)CD36表達(dá)下降促進(jìn)了自噬流。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,小鼠CD36的缺失明顯增強(qiáng)了肝臟組織內(nèi)自噬;而在CD36-/-小鼠中,CD36表達(dá)的重建降低了肝臟組織自噬。肝細(xì)胞CD36的敲降增強(qiáng)了脂噬,促進(jìn)了β氧化,降低了TG含量,上調(diào)了CPT1a的表達(dá),而抑制自噬后,脂噬和β氧化減弱。CD36表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)了肝細(xì)胞或肝臟組織中AMPK的激活,而抑制AMPK后,自噬再次下降,脂質(zhì)含量再次增多。肝細(xì)胞CD36的敲降增強(qiáng)了ULK1、p-ULK1(Ser555)、Beclin1、p-Beclin1(Ser93)的蛋白水平,降低了FOXO1的表達(dá),增強(qiáng)了p-FOXO1水平,而mTOR、p-mTOR、ATG7水平無明顯改變。抑制AMPK后,ULK1和p-ULK1(Ser555)水平下降。結(jié)論:在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,CD36的表達(dá)負(fù)向調(diào)節(jié)自噬。肝細(xì)胞CD36的敲降,通過AMPK-ULK1/Beclin1途徑,增強(qiáng)了脂噬及脂肪酸β氧化,減輕了脂質(zhì)累積。這提示我們,降低CD36的表達(dá)除了可減少脂肪酸攝取以外,還可通過誘導(dǎo)脂噬來增強(qiáng)脂肪酸的清除,這可能成為治療脂肪肝疾病和其他代謝性疾病的潛在策略。
【圖文】：

厚度的超薄切片，，用醋酸鈾和枸緣酸鉛染色。3)上機(jī)：用透射電鏡觀察，拍照，保存。1.2.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 GrapphPad Prism5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較以方差分析、獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P< 0.05 被認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 結(jié)果2.1 高脂飲食下小鼠體重增長(zhǎng)明顯每周稱量小鼠體重，結(jié)果顯示，HFD 組小鼠體重及體重的增長(zhǎng)明顯高于 NCD組小鼠（圖 1-1）。

圖 1-2 正常飲食和高脂飲食下小鼠肝組織脂質(zhì)含量igure 1-2 The lipid content in liver tissue of mice fed with NCD and HFD觀察小鼠肝組織脂質(zhì)沉積情況；B: 檢測(cè)小鼠肝組織 TG 和 FFA 含量。n=6以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*表示與 NCD 組比較，P<0.05。id accumulation in liver tissue of mice were evaluated by HE staining; B: Thntents in mouse livers were detected. n=6, data were presented as the mean*represents p<0.05 vs. NCD groups.食下小鼠肝臟組織 CD36 表達(dá)增加，自噬水平下降rn blotting 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD 組小鼠肝臟組織 CD36 表達(dá)水平顯 LC3Ⅱ水平顯著低于 NCD 組，p62 蛋白水平明顯高于 NCD 組（圖
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 牟婕;馮文靜;王珊;馮美蘋;毛擁軍;;自噬調(diào)控衰老的研究進(jìn)展[J];中華老年多器官疾病雜志;2019年01期

2 李黎;季漪;李文婷;馬艷霞;李沐涵;吳勉華;;基于細(xì)胞自噬的中醫(yī)藥抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥雜志;2019年01期

3 汪艷;;調(diào)控自噬在臨床肝病治療性應(yīng)用的轉(zhuǎn)化研究[J];肝臟;2019年07期

4 韓蘇夏;蔡夢(mèng)嬌;;自噬在腫瘤治療策略中的角色[J];西部醫(yī)學(xué);2018年09期

5 周岐鳴;劉洋;季光;宋海燕;;調(diào)節(jié)自噬改善非酒精性脂肪性肝病的藥物研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2018年10期

6 李曉瓊;何玲玲;李新毅;;自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究進(jìn)展[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2018年10期

7 馬文科;戴舒惠;羅鵬;楊悅凡;費(fèi)舟;;線粒體自噬的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年06期

8 付婉;董笛;趙穎;;自噬的相關(guān)分子機(jī)制[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2017年05期

9 方聰聰;毛善平;董慧敏;劉寶輝;王舜;;線粒體自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];卒中與神經(jīng)疾病;2017年02期

10 李旭卉;吳習(xí)習(xí);張凱;羅海霞;李敏;;線粒體自噬與癌癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 肖伊寧;呂佩源;;選擇性自噬的研究進(jìn)展[A];7th中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)全國(guó)中青年神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨第十屆全國(guó)神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病與腦脊液細(xì)胞學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2014年

2 胡成楓;胡春蘭;陳良標(biāo);;自噬在斑馬魚細(xì)胞冷應(yīng)激過程中的作用機(jī)制探究[A];2017年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2017年

3 肖伊寧;呂佩源;;選擇性自噬的研究進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下）[C];2014年

4 秦正紅;粱中琴;陶陸陽;黃強(qiáng);劉春風(fēng);蔣星紅;倪宏;邢春根;;自噬在細(xì)胞生存與死亡中的作用[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

5 秦正紅;;自噬與腫瘤和神經(jīng)細(xì)胞生存——藥物作用的新靶位[A];全國(guó)生化與分子藥理學(xué)藥物靶點(diǎn)研討會(huì)論文摘要集[C];2008年

6 余慧芬;唐李;李妍;;自噬現(xiàn)象對(duì)腫瘤發(fā)生影響的研究進(jìn)展[A];2017第七屆泛環(huán)渤海生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2017年

7 王菲菲;邱學(xué)敏;王凌;;自噬對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)作用[A];第9屆中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科專業(yè)委員會(huì)第二次學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2017年

8 申森森;李林楠;徐林楠;白玉;劉虎威;;基于氣相色譜-高分辨質(zhì)譜的饑餓誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞自噬過程的代謝組學(xué)研究[A];第21屆全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)及儀器展覽會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

9 任栓成;倪娜娜;胡志安;;睡眠覺醒期神經(jīng)元自噬活動(dòng)的變化[A];中國(guó)睡眠研究會(huì)第九屆學(xué)術(shù)年會(huì)匯編[C];2016年

10 蔣緒順;;自噬在棕櫚酸誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制[A];2016年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腎臟疾病專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2016年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 李潔尉　通訊員 周飛;花櫚木通過“自噬”殺死癌細(xì)胞[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2011年

2 王建新 主持;“自噬”的快車剛剛啟動(dòng)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2016年

3 記者 周潔;解密“自噬”，抗癌治病更近一步[N];河北日?qǐng)?bào);2016年

4 記者 陸琦 見習(xí)記者 谷雙雙;細(xì)菌通過誘導(dǎo)線粒體自噬求存活[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

5 本報(bào)記者 房琳琳;“自噬機(jī)制”帶來對(duì)抗衰老新希望[N];科技日?qǐng)?bào);2016年

6 生命學(xué)院;俞立課題組在《科學(xué)》發(fā)文揭示自噬調(diào)控的重要機(jī)制[N];新清華;2012年

7 本報(bào)實(shí)習(xí)生 劉如楠 記者 李晨陽;最新研究揭秘植物是怎樣衰老的[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

8 本報(bào)首席記者 唐聞佳;上海與新科諾獎(jiǎng)得主頗有學(xué)術(shù)緣[N];文匯報(bào);2016年

9 記者 陶婷婷;成功揭示代謝降解調(diào)控新機(jī)制[N];上海科技報(bào);2013年

10 記者 白毅;浙大二院發(fā)現(xiàn)大氣顆粒污染誘導(dǎo)呼吸道自噬性損傷新機(jī)制[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2015年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 羅小暖;柯薩奇病毒B3型通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起自噬的研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2018年

2 周麗娜;α-硫辛酸對(duì)帕金森病模型自噬的影響及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

3 夏廣昊;人胰島淀粉樣多肽對(duì)β細(xì)胞自噬的影響及羅格列酮促進(jìn)自噬機(jī)理研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

4 楊洋;PGD2-DPs途徑通過調(diào)控自噬參與糖尿病腦損傷機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

5 李照東;肌微管素相關(guān)蛋白14(MTMR14)在人肝癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

6 李韻;脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36負(fù)向調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂噬及分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

7 李永麗;STAT3、自噬在非酒精性脂肪性肝炎炎癥中的作用及二甲雙胍抗炎機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

8 孫蘭弟;基于提高親電性的策略設(shè)計(jì)天然導(dǎo)向的抗炎試劑和自噬激活劑及其作用機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2015年

9 楊烽;Klotho對(duì)糖尿病腎臟病中細(xì)胞自噬作用的影響及其機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

10 曹文婷;miR-125b-5p在UVB影響SLE自噬中的作用機(jī)制[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 葉妤;自噬調(diào)控慢性鼻-鼻竇炎中MUC5AC表達(dá)作用的研究[D];南昌大學(xué);2019年

2 楊小玲;自噬和能量代謝影響兔iPSCs的誘導(dǎo)效率[D];廣西大學(xué);2019年

3 陳思;miR-101通過靶向Atg4D抑制矽肺大鼠肺泡巨噬細(xì)胞自噬的作用研究[D];華北理工大學(xué);2019年

4 楊靜亞;ATG4D對(duì)染塵后大鼠肺泡巨噬細(xì)胞自噬流的影響[D];華北理工大學(xué);2019年

5 彭鑫;冬眠達(dá)烏爾黃鼠骨骼肌中自噬水平的變化與調(diào)控機(jī)制的研究[D];西北大學(xué);2019年

6 王友娣;SIDT2在脂肪組織自噬和分化成熟中的機(jī)制研究[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2019年

7 張帆;MiR-130b通過TGF-β1通路調(diào)節(jié)自噬對(duì)糖尿病腎臟纖維化的作用和機(jī)制的研究[D];河南科技大學(xué);2019年

8 陳柯;運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)腦缺血卒中大鼠腦自噬水平及Parkin表達(dá)的影響[D];成都體育學(xué)院;2019年

9 龍梅芳;PNA-TPP激活ROS誘導(dǎo)自噬促進(jìn)A549干細(xì)胞凋亡[D];南昌大學(xué);2019年

10 王克榮;漢坦病毒動(dòng)態(tài)調(diào)控自噬流拮抗宿主固有免疫應(yīng)答的分子機(jī)制及干預(yù)研究[D];西北大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2621024