【摘要】： 原位肝移植術(shù)是治療重型肝炎、肝硬化肝功能失代償?shù)冉K末期肝病最有效的治療手段。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肝移植手術(shù)的成功率不斷提高,術(shù)后生存時(shí)間不斷延長。但是,肝移植術(shù)后各種并發(fā)癥仍然是影響手術(shù)成功的一個(gè)重要因素,其中術(shù)后感染是繼移植排異后的另一常見的并發(fā)癥,發(fā)生率約為47%～80%,病死率達(dá)13%～36%。肝移植術(shù)后感染也是導(dǎo)致移植物慢性失功的重要原因之一,并將增加移植病人住院時(shí)間及醫(yī)療費(fèi)用。肝移植術(shù)后感染的常見病原體包括細(xì)菌(48%)、真菌(22%)、病毒(12%),以術(shù)后30天內(nèi)發(fā)生的內(nèi)源性感染最為常見,約31%的肝移植患者術(shù)后至少發(fā)生1次由多重耐藥細(xì)菌引起的感染,約69%的病原菌呈多重耐藥。由于肝臟與腸道在解剖結(jié)構(gòu)及功能上有著密切的聯(lián)系,腸道作為人體最大的貯菌所和內(nèi)毒素庫,在特定條件下可以釋放多種毒性物質(zhì),導(dǎo)致隱匿的內(nèi)源性感染。腸道微生態(tài)失衡、腸黏膜屏障損傷和腸滲透性增加、免疫功能失調(diào)是肝移植感染發(fā)生的重要原因。 本研究重點(diǎn)是肝硬化大鼠在肝移植前后腸道細(xì)菌的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)以及血清代謝譜的變化規(guī)律,旨在探明肝移植后腸道微生態(tài)變化與感染的關(guān)系,尋找與肝移植相關(guān)的特異性代謝靶分子,為進(jìn)一步探索通過重建、優(yōu)化腸道微生態(tài),減少肝移植后感染的發(fā)生,促進(jìn)移植受者長期健康存活提供新思路和新途徑。 本研究首先建立肝硬化大鼠的肝移植模型,繼而應(yīng)用16S rDNA分子微生態(tài)研究方法和核磁共振法(~1H NMR),對腸道細(xì)菌組成和血清代謝譜變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察,在國內(nèi)外未見類似的報(bào)道。 研究方法 1.四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)SD大鼠肝硬化模型 清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,雌雄各半,體重為180g～200g。分為兩組:對照組10只,造模組40只。模型制備方法:對照組大鼠無菌腹腔皮下注射花生油溶液;造模組大鼠無菌腹腔皮下注射40%CCL4花生油溶液。于給藥后4周、8周、12周、16周,分別處死2只造模大鼠,取肝,觀察肝臟病理進(jìn)展情況,持續(xù)16周復(fù)制大鼠肝臟病變模型。造模第16周處死造模組大鼠10只和對照組大鼠5只。剩余的造模組大鼠22只和對照組大鼠5只肝移植備用。 2.肝硬化SD大鼠肝移植模型的建立 選擇清潔級(jí)、體重為250g～300g的SD雄性大鼠19只作為供體;從CCL4造模組剩余的22只SD大鼠中,選擇體重相近的肝硬化大鼠14只,以及造模對照組剩余的5只SD大鼠作為受體。分為三組:肝硬化肝移植組(正常大鼠一肝硬化大鼠,9只),肝移植對照組(正常大鼠-造模對照組大鼠,5只),假手術(shù)組(肝硬化大鼠,5只,只打開腹腔便縫合)。大鼠原位肝移植模型采用經(jīng)典的Kamada二套袖法。所有的肝移植受體鼠移植前后均不使用抗生素,免疫抑制劑等。 3.標(biāo)本的收集 (1)血與糞便:在大鼠CCL4給藥前、CCL4給藥后4周、肝硬化時(shí)/移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天五個(gè)時(shí)間點(diǎn),收集所有大鼠的糞便。除CCL4給藥后4周外、其他的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)采集全血。 (2)下腔靜脈血、肝、脾、腎組織:在肝硬化/肝移植前(造模組10只、對照組5只)以及肝移植術(shù)后30天(所有19只移植受體鼠)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,收集下腔靜脈血、肝、脾、腎組織。 4.標(biāo)本檢測方法 (1)鱟試驗(yàn)法:檢測大鼠血漿內(nèi)毒素水平。 (2)核磁共振法(~1H-NMR):檢測大鼠血清代謝譜。 (3)細(xì)菌需氧與厭氧培養(yǎng)法:取大鼠肝、脾、腎組織,立即研磨,做細(xì)菌需氧與厭氧培養(yǎng)及生化鑒定,分析細(xì)菌易位發(fā)生率及易位細(xì)菌種類。 (4)細(xì)菌熒光定量PCR法:從大鼠糞便抽提總DNA,分別采用腸道六大菌屬(腸球菌、腸桿菌、擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌)的特異性引物,進(jìn)行熒光定量PCR檢測。 (5)聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳指紋圖譜(PCR-DGGE)分析:用16SrDNA V3區(qū)的通用引物和擬桿菌屬、梭菌屬和雙歧桿菌屬特異性引物作PCR-DGGE指紋圖譜,對腸道細(xì)菌總體變化趨勢和以上三種菌屬的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析并作克隆測序。 5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn),率的統(tǒng)計(jì)用χ2檢驗(yàn),采用MATLAB軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)。 研究結(jié)果 1.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后細(xì)菌易位情況 肝移植術(shù)后30天,大鼠肝、脾、腎細(xì)菌易位率達(dá)66%,遠(yuǎn)高于肝硬化/移植前細(xì)菌易位率(10%),兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。細(xì)菌易位部位以肝臟最為常見,脾臟次之,腎臟少見。肝硬化肝移植組的易位細(xì)菌種類以糞腸球菌、銅綠假單孢菌、大腸埃希菌為主,而肝硬化/肝移植前的易位細(xì)菌種類則以銅綠假單孢菌為主。 2.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后腸道細(xì)菌的定量變化 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCL4給藥前、給藥后4周、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天),動(dòng)態(tài)觀察大鼠糞便中六大優(yōu)勢菌的定量變化。結(jié)果顯示,與肝移植對照組相比,肝硬化肝移植組在肝硬化發(fā)展過程中,腸道擬桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌數(shù)量不斷下降,肝移植術(shù)后細(xì)菌數(shù)量逐步回升,至肝移植術(shù)后30天基本恢復(fù)至造模前水平。腸道雙歧桿菌屬在肝硬化造模過程中菌量升高,但在肝移植術(shù)后7天開始顯著下降,術(shù)后30天部分恢復(fù)。腸道乳酸菌屬和腸球菌屬在肝硬化造模過程中細(xì)菌含量改變不明顯。 3.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后腸道細(xì)菌總體分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化 采用PCR-DGGE方法,借助通用引物,對腸道所有細(xì)菌的16S rDNAV3區(qū)(可變區(qū))進(jìn)行擴(kuò)增,選擇4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCL4給藥前、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天),觀察大鼠腸道菌群總體分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)組內(nèi)比較結(jié)果顯示,CCL4給藥前,大鼠腸道細(xì)菌的總體分子生態(tài)組成差異小,基本聚成一類;肝硬化/肝移植前,腸道細(xì)菌的總體分子生態(tài)組成差異增大,分布彌散,不能聚成一類;至肝移植術(shù)后30天,腸道細(xì)菌的總體分子生態(tài)組成差異減小。(2)組間比較結(jié)果顯示,肝移植術(shù)后30天組與CCL4給藥前組相比差異最大,但與肝移植術(shù)后7天組相比差異不明顯。 4.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后腸道擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化 應(yīng)用類群特異性PCR-DGGE方法,進(jìn)一步觀察腸道各優(yōu)勢菌屬(擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬)在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCL4給藥前、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天)的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)組內(nèi)比較結(jié)果顯示,CCL4給藥前,大鼠腸道擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬的組內(nèi)分子生態(tài)組成均相似,基本上均聚成一類;CCL4給藥后,上述各菌屬的組內(nèi)分子生態(tài)組成差異均增大,分布彌散。(2)組間比較結(jié)果顯示,擬桿菌屬肝硬化/肝移植前組、肝移植術(shù)后術(shù)后7天、肝移植術(shù)后術(shù)后30天組與CCL4給藥前組相比差異均明顯,特別是術(shù)后30天組最為顯著,而術(shù)后7天組與肝硬化/肝移植前組的距離較近;梭菌屬肝硬化/肝移植前組、肝移植術(shù)后30天組與CCL4給藥前組相比差異均明顯,特別是術(shù)后30天組,而在術(shù)后7天組基本恢復(fù)到CCL4給藥前組水平;雙歧桿菌屬肝硬化/肝移植前組與CCL4給藥前組相比差異明顯,分子生態(tài)結(jié)構(gòu)不能聚類,分布在各個(gè)象限,但術(shù)后7天組與術(shù)后30天組相比,能聚集在一起,提示在肝移植術(shù)后,腸道雙歧桿菌屬的組成能較快恢復(fù)穩(wěn)定。 5.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后血清代謝譜的變化 應(yīng)用核磁共振法(~1H-NMR),結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析,選擇4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCL4給藥前、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天),動(dòng)態(tài)觀察22只大鼠的血清代謝譜(18種物質(zhì))變化。結(jié)果顯示,大鼠肝硬化/肝移植前,血清乳酸、高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸、甜菜堿明顯上升,而谷氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白、葡萄糖、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂肪酸、乙酸出現(xiàn)下降。隨著供肝的植入,大鼠血清代謝物的異常逐漸消失,代謝物恢復(fù)正常所需的時(shí)間各不相同。用主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn),CCL4給藥前組、肝硬化/肝移植前組、肝移植術(shù)后7天組的血清代謝譜完全分離,分布在不同的區(qū)域,說明它們的代謝譜完全不同,但肝移植術(shù)后30天組與CCL4給藥前組的血清代謝譜有部分重疊,提示此時(shí)的代謝譜已有部分恢復(fù)。 結(jié)論 本研究采用系統(tǒng)生物學(xué)方法,對SD大鼠肝硬化前后、肝移植前后不同時(shí)間點(diǎn)腸道細(xì)菌的分子生態(tài)組成及血清代謝譜進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,證實(shí)大鼠肝移植術(shù)后存在腸道菌群與血清代謝失衡,發(fā)現(xiàn)了腸道六大類優(yōu)勢菌屬及血清代謝譜的變化規(guī)律與變遷模式,為下一步尋找功能菌以及用微生態(tài)制劑(包括益生菌等)恢復(fù)正常菌群結(jié)構(gòu)、保護(hù)腸黏膜屏障、減少細(xì)菌易位和移植感染的發(fā)生提供了一個(gè)創(chuàng)新的思路。
【圖文】：

因此，“在病理狀態(tài)下，腸道就像是個(gè)未被引流的膿腫”【0芍一8】。肝移植過程中，腸道菌群出現(xiàn)失衡，，易發(fā)生腸道細(xì)菌易位。細(xì)菌易位首先要突破四層屏障:腸道正常菌群、腸道鉆液層、腸上皮細(xì)胞層、腸道免疫屏障(見圖0一1)。腸道微生態(tài)失衡、腸鉆膜屏障損傷和腸滲透性增加、免疫功能失調(diào)是導(dǎo)致腸道細(xì)菌易的重要原因，后者則是發(fā)生肝移植感染的重要原因。本研究重點(diǎn)是腸道微生態(tài)失衡對肝移植感染的影響。在本研究中，我們應(yīng)用CCL4誘導(dǎo)大鼠肝硬化動(dòng)物模型，然后進(jìn)行肝移植，動(dòng)態(tài)研究肝硬化成模前后、肝移植術(shù)前術(shù)后不同時(shí)間腸道微生態(tài)六大優(yōu)勢菌的定量與定性改變規(guī)律以及細(xì)菌易位的特點(diǎn)，明確腸道微生態(tài)改變與移植感染的關(guān)系。我們應(yīng)用 165rDNA方法研究腸道細(xì)菌的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)，有別于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法，在國內(nèi)外未見類似報(bào)道。表面活性劑SUrf曰Ctant火毅液層岸腸粘膜編廠Ep比heliL，m上皮細(xì)胞圖0一1

是蛋白質(zhì)合成必需的，并且結(jié)構(gòu)和功能都是保守的(見表。一1);(2)165rDNA的基因序列由n個(gè)保守區(qū)(C區(qū))和10個(gè)可變區(qū)(v區(qū))交替組成，保守區(qū)在細(xì)菌中高度保守，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究基礎(chǔ)(見圖0一2)。因此，既可以利用保守區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，又可以利用高變區(qū)來進(jìn)行序列間的比對 ;(3)165rDNA的序列變化比較緩慢，而且在原核生物中不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，因此， 165rDNA之間4
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575.2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李政鋒;阮冰;;肝移植與腸道微生態(tài)[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2012年07期

本文編號(hào)：2620601