【摘要】： 目的：探討尋找一種簡(jiǎn)便的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)分離、培養(yǎng)及保存、復(fù)蘇方法，觀察經(jīng)過不同培養(yǎng)時(shí)間(3天，7天)時(shí)H．pylori菌落及鏡下菌體的形態(tài)，采用一種新的細(xì)菌保存方法，觀察H．pylori處于不同形態(tài)時(shí)保存1年后復(fù)蘇的成功率；并采用E-test方法檢測(cè)沈陽地區(qū)感染的H．pylori對(duì)4種不同抗生素，即克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林及四環(huán)素的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)值，觀察沈陽地區(qū)的H．pylori對(duì)各種抗生素的耐藥情況，，并對(duì)其中篩選出的對(duì)克拉霉素耐藥的H．pylori菌株，PCR法擴(kuò)增其23S rRNA基因中2047-2347之間的片段，并對(duì)該片段進(jìn)行序列分析，觀察耐藥株的耐藥機(jī)制。 方法：首先對(duì)有消化系統(tǒng)癥狀的患者，進(jìn)行胃鏡檢查，對(duì)其中消化性潰瘍、慢性胃炎及胃癌等病人，取胃竇粘膜1塊，經(jīng)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)為比pylori感染陽性者，再取胃竇粘膜2塊，無菌條件下切碎，接種于含10％新鮮脫纖維兔血的Columbia平板培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)罐中，封蓋，負(fù)壓抽成真空，再灌入微需氧氣體(5％O_2，10％CO_2，85％N_2)，于37℃、90％以上濕度的條件下培養(yǎng)3天，觀察菌落形態(tài)及Gram染色后顯微鏡下菌體形態(tài)，并經(jīng)尿素酶、氧化酶及觸酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)為H．pylori，取典型菌株進(jìn)行傳代純培養(yǎng)，分別于不同培養(yǎng)時(shí)間(3天，7天)時(shí)，用無菌棉簽將平板上的H．pylori菌株移入裝有3ml滅菌脫脂奶的小瓶中，封蓋，于-80℃深低溫下保存。一年后，隨機(jī)取出傳代培養(yǎng)3天和7天時(shí)保存的H．pylori菌株，共8株，分別接種于Columbia血平板培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)蘇。在傳代培養(yǎng)中，取H．pylori純菌落，用無菌生理鹽水配制成濃度為1McFrand的菌懸液，用無菌棉簽蘸取H．pylori菌液均勻 涂布于含10%新鮮脫纖維兔血的Muel ler一Hinton培養(yǎng)基中，在15 分鐘內(nèi)將E一tset試紙條帖于培養(yǎng)基中央，并立即開始于37℃、微 需氧條件下培養(yǎng)，3一5天后觀察H.pylori生長(zhǎng)情況，讀取 H.pylori對(duì)不同抗生素的MIC值，判斷H.pylori的耐藥性，耐藥 標(biāo)準(zhǔn):克拉霉素MIC值)smg幾，甲硝哇Mlc)8 mg幾，阿莫西林 Mlc值)Zm叭，四環(huán)素Mlc值)sm叭。在一80℃深低溫下保存 的H.pylori中，選出其中對(duì)克拉霉素耐藥的H.pylori菌株3株， No.13(MIC smg/L)，Nol7(MIC 64 mg/L)，No22(MIC )256mg/L)，及敏感株1株，No.33(MIC 0.125mg/L)，進(jìn)行復(fù)蘇 后，用0.01M的PBS lml將菌膜從Columbia平板上沖洗下來，沖洗 液收集于1.5ml enphendoff管中，3000r/smins進(jìn)行離心，取沉 淀，采用酚一氯仿方法提取H.pylori的DNA。按文獻(xiàn)報(bào)告資料設(shè)計(jì) 引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，上游引物 序列為:5，一CTG CAT GAA TGG CGT AAC GAG一3，(與 H.Pylori 235 rRNA基因序列中2047一2067片段堿基互補(bǔ))，下游引 物序列為:5，一GAG CGA CCG CCC CGA TCA AAC一3，(與 H.Pylori 235 rRNA基因序列中2347一2327片段堿基互補(bǔ))。PCR 循環(huán)體系共Zoul，其中包括 dd HZO(雙蒸水)13.3ul，lox pCR buffer 2.5ul，dNTPS(2.SlnM)2ul，Taq酶(su/ul)0.2 ul，引物 (1:sx)1.5ul，DNA Sajnple 0.5 ul.PCR循環(huán)條件為:94oC4分 鐘，94℃40秒，61.5℃1分鐘，72℃1分鐘，72℃7分鐘，共進(jìn)行 32個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物跑870聚丙烯酸胺凝膠電泳，觀察PCR產(chǎn)物純 度。選擇電泳條帶單一而明亮的樣品，按上述條件擴(kuò)增SOul，將含 有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的enphendoff管裝入冰盒中，送交上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司，進(jìn)行序列分析，比較耐藥菌與敏感菌的235 rRNA基因中目的片斷的序列，以確定與耐藥有關(guān)的突變情況。 結(jié)果:1.H.pylori菌落為針尖狀，半透明，原代培養(yǎng)中菌落 稀少，不融合。GraJIn染色后，鏡下(1000x) H.pylori在不同培養(yǎng) 時(shí)間分別呈現(xiàn)不同形態(tài)，如彎曲狀、桿狀或短棒狀、球狀，將后二 者重新傳至新鮮培養(yǎng)基后，形態(tài)可恢復(fù)至彎曲狀或桿狀。1年后， 隨機(jī)取出培養(yǎng)3天時(shí)于脫脂奶中深低溫保存的6株H.Pylori，均復(fù) 蘇成功;而培養(yǎng)7天時(shí)即球形體時(shí)保存的菌株未能復(fù)蘇成功。復(fù)蘇 的H.pylori菌落大小、形態(tài)一致，且較密集，呈半融合狀態(tài)。鏡下 觀察H.pylori菌體為彎曲狀或桿狀，少數(shù)H.pylori菌體變長(zhǎng)，更 加彎曲，類似絲狀。 2.30例H.pylori菌株中有7例對(duì)克拉霉素耐藥(MICS在 8一256mg/ml)，耐藥率為23，3ry0;12例對(duì)甲硝哩耐藥(MICS在24- 256mg/ml)，耐藥率為4Oyo;O例對(duì)阿莫西林耐藥，耐藥率為O%，2 例對(duì)四環(huán)素耐藥(MIC分別為16mg/ml和32mg/ml)，耐藥率為6.7%。 3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為30lbp的核普酸片斷，電泳圖譜提示 反應(yīng)體系中只含有單一的目的片斷，無污染、無雜帶。No.33為克 拉霉素敏感H.pylori菌株，No.13、17、22分別為低度、中度及高 度克拉霉素耐藥的H.pylori菌株。從基因測(cè)序圖譜中可以發(fā)現(xiàn): 敏感株No.33共測(cè)出278個(gè)堿基，與敏感菌(No.33)序列比較， No.13(低度耐藥株)共測(cè)出279個(gè)堿基，其中存在一個(gè)突變位點(diǎn)， 即2289位點(diǎn)T變成了C(T2289C)，No.17(中度耐藥株)共測(cè)出 278個(gè)堿基，其中存在2個(gè)突變位點(diǎn)，即G2224A、T2289C，No.22 (高度耐藥株)共測(cè)出278
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R57

【引證文獻(xiàn)】

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1 李芳;劉榮臻;原素梅;高艷萍;張曉妍;張海芳;任玉英;;幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)[J];衛(wèi)生職業(yè)教育;2008年05期

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1 李芳;山西省呂梁市幽門螺桿菌耐藥性的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2618844