【摘要】：目的 1.研究NK細(xì)胞功能與HCV感染及抗病毒治療后不同轉(zhuǎn)歸間的關(guān)系; 2.比較丙型肝炎患者NK細(xì)胞功能的體內(nèi)外差異; 3.探討丙肝患者抗病毒治療過程中NK細(xì)胞功能的動態(tài)變化及其與病毒載量、基因型的關(guān)系。 方法 1.病例:(1)慢性HCV感染患者49例,其中未治療者30例,應(yīng)用IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療者19例(2)感染HCV后自發(fā)清除病毒者5例(3)經(jīng)過抗病毒治療后持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答患者18例(4)經(jīng)過抗病毒治療后非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答患者17例(5)健康對照18例。已排除其它病毒合并感染,取外周肝素鈉抗凝血備檢。 2.采用ELISA檢測HCV抗體,序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)方法檢測HCV基因分型。應(yīng)用Real time-PCR定量檢測HCV-RNA水平,包括未治療、治療后持續(xù)或非持續(xù)應(yīng)答及自發(fā)恢復(fù)的丙肝患者在入組時;接受治療的病人在治療前及治療4周、12周、24周時間點(diǎn)。 3.采用易得人淋巴細(xì)胞分離管分離出外周血單個核細(xì)胞(PBMC),利用CFSE/PI染色方法檢測NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性。 4.流式染色技術(shù)檢測NK細(xì)胞及其亞型的頻率,NK細(xì)胞表面激活及抑制性受體的頻率,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α的分泌情況。 5.將一部分健康對照及慢性丙肝患者分離出的PBMC加入細(xì)胞因子(rh IL-2及rh IL-15)進(jìn)行體外培養(yǎng),72h后檢測NK細(xì)胞表面受體及分泌細(xì)胞因子的變化。 6. Flowjo Software對流式圖進(jìn)行處理,SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,p值0.05認(rèn)為有顯著差異性。 結(jié)果 1.慢性HCV感染及治療后不同轉(zhuǎn)歸患者組間NK細(xì)胞、亞型、表面受體、殺傷活性及分泌細(xì)胞因子頻率的比較 (1)慢性丙肝患者外周血NK細(xì)胞殺傷活性,表達(dá)受體NKG2D及分泌細(xì)胞因子IFN-γ, TNF-α頻率明顯低于健康對照組(p0.01),受體NKG2C顯著低于自發(fā)恢復(fù)組(p0.01);受體NKp30, NKp44及NKG2A顯著低于持續(xù)應(yīng)答組(p0.05)。 (2)與治療后持續(xù)應(yīng)答患者相比,非持續(xù)應(yīng)答者NK細(xì)胞殺傷活性顯著減低(p0.01);此外其殺傷活性,受體NKG2D及分泌細(xì)胞因子IFN-γ, TNF-α頻率明顯低于健康對照,受體NKG2A則相反(p0.05)。 (3)持續(xù)應(yīng)答患者NK細(xì)胞表面活化性受體NKp46,NKp30,NKp44,NKG2D及NKG2A與較非持續(xù)應(yīng)答者高,分泌細(xì)胞因子IFN-γ, TNF-α能力亦較強(qiáng),但沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異。 (4)自發(fā)恢復(fù)的HCV感染者外周血NK細(xì)胞、受體NKp46、NKG2C及分泌細(xì)胞因子TNF-α頻率高于非持續(xù)應(yīng)答患者(p0.05)。 2.體外培養(yǎng)后,慢性HCV感染患者NK細(xì)胞頻率降低,顯著低于健康對照組培養(yǎng)以后(p0.01),但受體NKG2A及NKG2C頻率增加,高于健康對照組(p0.05)。非持續(xù)應(yīng)答組細(xì)胞體外培養(yǎng)后,NK細(xì)胞分泌IFN-γ及TNF-α均低于健康對照組培養(yǎng)后(p0.05)。 3.慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者血清病毒滴度及ALT水平與NK細(xì)胞功能無相關(guān)性。 4.慢性丙肝患者治療過程中NK細(xì)胞、亞型及表面受體的頻率和功能活性變化 (1)低病毒載量及非基因1型患者CD56dim NK細(xì)胞頻率下降,CD56bright NK細(xì)胞頻率增加。 (2)低病毒載量及非基因1型患者抑制性受體NKG2A頻率增加,高病毒載量及基因1型患者活化性受體NKG2D減少。 (3)高病毒載量及基因1型患者NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ, TNF-α能力下降 結(jié)論 1.NK細(xì)胞功能與HCV感染及治療后轉(zhuǎn)歸有關(guān),慢性HCV感染者體內(nèi)NK細(xì)胞功能受損,自發(fā)恢復(fù)者及治療持續(xù)應(yīng)答患者NK細(xì)胞活性高于慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者。 2.慢性丙肝患者體內(nèi)外NK細(xì)胞功能與健康人存在差別。 3.慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者血清病毒滴度、ALT水平與NK細(xì)胞功能無相關(guān)性。 4.與低病毒載量及非基因1型患者相比,高病毒載量及基因1型患者在抗病毒治療過程中NK細(xì)胞功能活性沒有得到改善甚至降低。 本課題的創(chuàng)新點(diǎn) 1.比較系統(tǒng)地研究了NK細(xì)胞功能活性與HCV感染及治療后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。 2.對丙肝患者體內(nèi)外NK細(xì)胞功能的對比研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識NK細(xì)胞功能與HCV感染的關(guān)系。 3.動態(tài)監(jiān)測丙肝患者抗病毒治療過程中NK細(xì)胞功能的變化,以期預(yù)測患者對治療的應(yīng)答及治療后的轉(zhuǎn)歸。 本課題研究的意義 1.研究結(jié)果顯示NK細(xì)胞功能對HCV感染后轉(zhuǎn)歸及抗病毒治療效果均有直接影響,有助于我們更好地認(rèn)識丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制。 2.研究結(jié)果對于探索難治性丙肝的發(fā)生機(jī)制具有一定意義。
【圖文】：

圖 1-1.一例慢性丙肝患者 PBMC 中 NK 細(xì)胞及其亞型流式檢測圖。 A.在 PBMC中以淋巴細(xì)胞為門; B.CD3與CD56雙標(biāo)進(jìn)一步區(qū)分出CD3-CD56+NK 細(xì)胞; C. 峰度圖顯示 NK 細(xì)胞亞型 CD56dim及 CD56bright細(xì)胞

圖 1-1.一例慢性丙肝患者 PBMC 中 NK 細(xì)胞及其亞型流式檢測圖。 A.在 PBMC中以淋巴細(xì)胞為門; B.CD3與CD56雙標(biāo)進(jìn)一步區(qū)分出CD3-CD56+NK 細(xì)胞; C. 峰度圖顯示 NK 細(xì)胞亞型 CD56dim及 CD56bright細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R512.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Hepatitis C Virus Infection Downregulates the Ligands of the Activating Receptor NKG2D[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年06期

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本文編號：2609475