【摘要】：前言 胞漿硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)2Blb能夠催化膽固醇及羥基膽固醇的3β-羥基硫酸化,其催化25-羥化膽固醇(25HC)硫酸化反應(yīng)的主要產(chǎn)物為3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)。研究發(fā)現(xiàn)SULT2B1b能夠抑制羥基膽固醇對肝X受體(LXRs)的激活,并且其硫酸化產(chǎn)物可以通過抑制LXR/SREBPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平。而LXRs信號途徑的激活對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用。因此SULT2B1b及其硫化產(chǎn)物25HC3S可能對肝臟增生起重要作用。本實驗中,我們在小鼠正常肝臟、原代大鼠肝臟細(xì)胞(PRH)以及小鼠肝臟部分切除術(shù)(PH)模型中研究SULT2B1b對肝臟增生的作用及機(jī)制,并在小鼠正常肝臟中檢測SULT2B1b的硫化產(chǎn)物25HC3S對肝臟增生的影響及相關(guān)機(jī)制。 第一部分體內(nèi)外研究SULT2B1b對肝臟增生的影響 第一節(jié)SULT2B1b對小鼠肝臟增生以及原代大鼠肝細(xì)胞(PRH)生長的影響及相關(guān)機(jī)制 目的：探索SULT2B1b對小鼠肝臟以及PRH增生的影響及機(jī)制。 方法：將含有SULT2B1b基因的腺病毒感染C57BL/6(?)、鼠及PRH后,運(yùn)用PCNA免疫組織化學(xué)染色法檢測肝臟增生狀態(tài)；應(yīng)用免疫熒光雙染法定位肝臟內(nèi)SULT2B1b與PCNA的表達(dá)；采用siRNA干擾技術(shù)反面驗證SULT2B1b對肝細(xì)胞生長的影響；通過實時定量PCR和免疫印跡的方法檢測基因表達(dá)水平。 結(jié)果：體內(nèi)實驗表明小鼠肝臟組織中的PCNA陽性細(xì)胞率隨SULT2B1b表達(dá)水平的升高而明顯增加,并存在劑量和時間依賴性；肝臟內(nèi)幾乎所有存在PCNA表達(dá)的細(xì)胞核均伴隨SULT2B1b在細(xì)胞質(zhì)的高表達(dá),而沒有SULT2B1b表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)也檢測不到PCNA的表達(dá)。在SULT2B1b相對高表達(dá)的PRH內(nèi),采用RNA干擾技術(shù)抑制SULT2B1b基因的表達(dá),引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因CDK2, FoxM1b,與Cyclin A的表達(dá)明顯降低。此外,LXR人工合成激動劑T0901317可有效阻斷體內(nèi)夕(?) SULT2B1b所誘導(dǎo)的PCNA棩表達(dá)升高。 結(jié)論：SULT2B1b能夠通過抑制LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性促進(jìn)體內(nèi)外肝細(xì)胞增生。 第二節(jié)在部分肝切除術(shù)(PH)后的小鼠模型中研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機(jī)制 目的：研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機(jī)制。 方法：在C57BL/6小鼠體內(nèi)建立肝臟PH再生模型,并通過尾靜脈注射含有SULT2B1b基因的腺病毒或?qū)φ詹《�；病毒感�?天后,應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法分析肝再生過程中的PCNA陽性細(xì)胞率；采用HPLC技術(shù)檢測肝臟內(nèi)羥基膽固醇的變化；運(yùn)用實時定量PCR和免疫印跡法檢測基因表達(dá)水平。 結(jié)果：SULT2B1b過表達(dá)的小鼠肝臟恢復(fù)較快,約于術(shù)后三天恢復(fù)到肝臟原始大小的80%,而對照組需要將近5天達(dá)到同樣水平。SULT2B1b過表達(dá)增加了肝臟再生過程中的PCNA陽性細(xì)胞率以及增生相關(guān)基因的表達(dá)水平；降低了肝臟內(nèi)的羥基膽固醇含量以及LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游基因SREBP-1和ABCA1的表達(dá)水平。 結(jié)論：SULT2B1b能夠通過抑制羥基膽固醇/LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)肝臟損傷后的再生。 第二部分在小鼠體內(nèi)研究羥基膽固醇硫化物對肝臟增生的影響及其相關(guān)機(jī)制 目的：探索SULT2B1b的硫化產(chǎn)物(25HC3S)對小鼠體內(nèi)肝臟增生的影響及機(jī)制 方法：向C57BL/6小鼠尾靜脈直接注射3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)化合物,或向感染了腺病毒(Ad-SULT2B1b)兩天后的C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射25HC,建立高濃度外源性或內(nèi)源性25HC3S的小鼠模型；應(yīng)用[3H]標(biāo)記25HC3S并經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi),追蹤25HC3S在各組織器官中的分布及其藥代動力學(xué)：采用實時定量PCR,細(xì)胞周期PCR芯片以及免疫印跡法檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。以PCNA為增生標(biāo)記,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析肝臟中PCNA的陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果：外源性25HC3S給藥后在小鼠體內(nèi)廣泛分布于各組織器官,并在注射后48小時左右減至初始劑量的一半25HC3S的增加上調(diào)了肝臟內(nèi)增生相關(guān)基因Wtl, Pcna,cMyc, cyclin A, FoxM1b, CDC25b的表達(dá),卻下調(diào)了細(xì)胞周期停滯基因Check2以及凋亡誘導(dǎo)基因Apafl的表達(dá)；無論外源性給藥還是內(nèi)源性合成,25HC3S的應(yīng)用均有效增加了PCNA陽性細(xì)胞率,降低了LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游基因如ABCA1和SREBP-lc的表達(dá)；最后,LXR的人工合成激動劑T0901317的應(yīng)用有效阻止了25HC3S誘導(dǎo)的PCNA表達(dá)升高。 結(jié)論：25HC3S能夠促進(jìn)肝臟增生。羥基膽固醇硫酸化通過對LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制為肝臟增生的研究提供了新的靶點(diǎn)。 綜上所述,羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT2B1b)通過硫酸化羥基膽固醇,增加硫化羥基膽固醇(25HC3S)的產(chǎn)生,抑制LXR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性,從而促進(jìn)肝臟增生以及肝臟損傷后的再生恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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1 Hironobu Makino;Hiroaki Shimizu;Hiroshi Ito;Fumio Kimura;Satoshi Ambiru;Akira Togawa;Masayuki Ohtsuka;Hiroyuki Yoshidome;Atsushi Kato;Hideyuki Yoshitomi;Shigeaki Sawada;Masaru Miyazaki;;Changes in growth factor and cytokine expression in biliary obstructed rat liver and their relationship with delayed liver regeneration after partial hepatectomy[J];World Journal of Gastroenterology;2006年13期

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本文編號：2608848