【摘要】：慢性胰腺炎是臨床常見(jiàn)病,80-90%的慢性胰腺炎病人都有持續(xù)性腹部疼痛,其嚴(yán)重的、反復(fù)發(fā)作的腹部疼痛是病人的主要癥狀之一。然而,慢性胰腺炎導(dǎo)致疼痛的機(jī)制尚不明確,解釋其引起疼痛的機(jī)制也有很多,包括胰腺本身和胰腺外部原因。關(guān)于神經(jīng)病理性疼痛的研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛傳導(dǎo)通路發(fā)生了異常。有研究發(fā)現(xiàn)在某些胰腺病變,包括慢性胰腺炎、胰腺癌和胰性腦病,可以導(dǎo)致“神經(jīng)重塑“和胰腺神經(jīng)支配發(fā)生變化。以上結(jié)果提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能參與了慢性胰腺炎導(dǎo)致的慢性疼痛。 脊髓背角神經(jīng)-免疫系統(tǒng)和神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用在神經(jīng)可塑性變化和神經(jīng)病理性痛中起了十分重要的作用。有研究表明神經(jīng)-免疫系統(tǒng)相互作用在慢性胰腺炎疼痛中非常重要。以往表明脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠慢性胰腺炎模型發(fā)生了活化,同時(shí)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性可以減輕慢性胰腺炎引起的疼痛。我們推測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞在此過(guò)程中可能被某些受體活化,然后導(dǎo)致一系列分子表達(dá)變化和信號(hào)通路的活化,參與了慢性胰腺炎引起的疼痛。但是具體那種分子參與了慢性胰腺炎引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化未見(jiàn)報(bào)道。Toll樣受體(TLRs)在慢性痛病理?xiàng)l件下脊髓背角神經(jīng)-免疫相互作用和神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互作用中起到了十分重要的作用。有學(xué)者表明TLRs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,特別是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,有廣泛表達(dá)。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中TLRs的表達(dá)已經(jīng)被確認(rèn)。在這些受體中,TLR2-4被認(rèn)為主要介導(dǎo)了神經(jīng)病理性疼痛。通常來(lái)說(shuō),在內(nèi)源性或是外源性信號(hào)通路的刺激下,活化的TLRs能夠?qū)е律窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化,調(diào)節(jié)疼痛相關(guān)的炎癥因子。有趣的是,TLRs同樣有可能在胰腺炎的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了作用。最近有報(bào)道表明腹腔內(nèi)注射TLR3可以成功的引起慢性胰腺炎樣的病理變化。在本實(shí)驗(yàn)中,我們假設(shè)TLRs,尤其是TLR2-4,參與了慢性胰腺炎病理?xiàng)l件下星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和疼痛的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脊髓TLR3參與了大鼠慢性胰腺炎模型的疼痛。慢性胰腺炎病理?xiàng)l件下脊髓的“TLR3-星形膠質(zhì)細(xì)胞- IL-1β/MCP-1”的正反饋通路可能為TLR參與慢性胰腺炎疼痛的機(jī)制,或許可以成為臨床慢性胰腺炎病人疼痛的緩解的治療靶點(diǎn)。 目的: 慢性胰腺炎導(dǎo)致的疼痛的機(jī)制目前為止尚不明確。以前的很多結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛過(guò)程中得到了活化。盡管如此,星形膠質(zhì)細(xì)胞在慢性胰腺炎病理過(guò)程中是否發(fā)生了活化以及其發(fā)生活化的分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)的目的為探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在慢性胰腺炎病理過(guò)程中是否發(fā)生了活化以及TIRs是否參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和慢性胰腺炎引起的疼痛發(fā)作。 方法: 1.動(dòng)物分為慢性胰腺炎實(shí)驗(yàn)組,假手術(shù)組和正常組。雄性Sprague Dawley大鼠,體重250-300g,由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。術(shù)前大鼠禁食水12h。麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,常規(guī)消毒,沿腹白線做正中切口剖腹,尋找十二指腸并找到胰腺,用微型動(dòng)脈夾阻斷胰膽管肝門部。用4號(hào)靜脈頭皮針經(jīng)腸壁穿刺入胰膽管,并用絲線固定靜脈針,通過(guò)恒流靜脈輸液泵注射含2%TNBS的PBS(PH 7.4),共0.4ml,持續(xù)60min,注畢后關(guān)閉恒流泵,維持壓力50min。對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。除去動(dòng)脈夾及絲線,逐層關(guān)閉腹腔。整個(gè)手術(shù)操作過(guò)程嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。檢測(cè)各組血清和胰腺組織細(xì)胞因子(TNF-?、IL-1。COX-1和α-SMA)的表達(dá)變化。分別于0點(diǎn),1周和5周對(duì)各組大鼠胰腺HE染色后進(jìn)行病理評(píng)分。同時(shí)從0點(diǎn)到第5周實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各組大鼠的RFs值。利用免疫熒光和RE-PCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá),west blotting檢測(cè)TLR2-4在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)研究TLR3與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的共存關(guān)系。 2.慢性胰腺炎組給予LAA拮抗星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性,利用RT-PCR驗(yàn)證LAA拮抗效果;同時(shí)檢測(cè)RFs值的和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的變化情況。 3.慢性胰腺炎組給予TLR3反義探針拮抗TLR3的表達(dá),利用west blotting驗(yàn)證TLR3反義探針拮抗效果;同時(shí)檢測(cè)RFs值的和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的變化情況。 4. RT-PCR檢測(cè)各組大鼠脊髓細(xì)胞因子,如TNF-?, IL-1, IL-6,COX2和MCP-1的變化情況。 結(jié)果: 1.在假手術(shù)組和正常組,胰腺組織HE染色表現(xiàn)正常。在TNBS注射5周后,實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺HE染色表現(xiàn)出明顯的胰腺腺泡萎縮,炎細(xì)胞浸潤(rùn),組織纖維化和間質(zhì)增生。血清淀粉酶、TNF-?和IL-1在實(shí)驗(yàn)組顯著升高。胰腺組織的TNF-?、IL-1、COX-1和α-SMA顯著升高。在此同時(shí),TNBS注射可導(dǎo)致RFs值的從開(kāi)始到第5周的持續(xù)性升高。而假手術(shù)組和正常組RFs值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNBS注射組5周時(shí)RFs值與刺激正相關(guān)。與臨床慢性胰腺炎病人癥狀非常相似。因此我們確認(rèn)TNBS可導(dǎo)致大鼠慢性胰腺炎以及腹部疼痛敏感度的增高。 2.我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)處理各組大鼠觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP表達(dá)的變化情況。免疫熒光和RT-PCR結(jié)果顯示在假手術(shù)組和正常組,GFAP在胸椎背角的表達(dá)很低。在實(shí)驗(yàn)組,有趣的是,脊髓GFAP的表達(dá)從TNBS注射后第1周到第5周顯著升高,第5周達(dá)到高峰,其表達(dá)的變化與疼痛的變化成正相關(guān)。因此我們假設(shè)GFAP可能介導(dǎo)慢性胰腺炎導(dǎo)致的疼痛。 3.我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)處理各組大鼠觀察TLR2-4蛋白表達(dá)的變化情況。Western blotting結(jié)果顯示在假手術(shù)組和正常組,TLR2-4在胸椎背角的表達(dá)很低。在實(shí)驗(yàn)組,有趣的是,脊髓TLR3的表達(dá)從TNBS注射后第一周到第五周顯著升高,第5周達(dá)到高峰,其表達(dá)的變化與疼痛的變化成正相關(guān),這與以往我們的研究表明脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)變化非常一致。因此我們假設(shè)TLR3可能在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá),同時(shí)介導(dǎo)慢性胰腺炎導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。免疫雙標(biāo)顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP與TLR3的共表達(dá),初步證實(shí)了我們的假設(shè)。 4.接下來(lái)我們鞘內(nèi)注射GFAP的活性抑制劑LAA。RT-PCR證實(shí)了其拮抗效果。鞘內(nèi)注射LAA在一定程度上可以緩解慢性胰腺炎引起的疼痛,這種效應(yīng)為計(jì)量依賴性。在假手術(shù)組或正常組,鞘內(nèi)注射LAA對(duì)RFs無(wú)影響。這些結(jié)果提示GFAP有可能參與到慢性胰腺炎導(dǎo)致的疼痛。接下來(lái)我們鞘內(nèi)注射TLR3的反義探針拮抗TLR3的功能,western blotting證實(shí)了其拮抗效果。鞘內(nèi)注射TLR3的反義探針在一定程度上可以緩解慢性胰腺炎引起的疼痛,這種效應(yīng)為計(jì)量依賴性。在假手術(shù)組或正常組,鞘內(nèi)注射TLR3反義探針對(duì)RFs無(wú)影響。這些結(jié)果暗示了TLR3有可能參與到慢性胰腺炎導(dǎo)致的疼痛�？紤]到TLR3在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的高表達(dá),接下來(lái)我們探討了TLR3反義探針對(duì)于慢性胰腺炎介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR3反義探針顯著抑制了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。然后我們又檢測(cè)了脊髓炎癥因子的表達(dá)情況,脊髓IL-1?,TNF-?,IL-6和MCP-1在慢性胰腺炎組表達(dá)明顯升高,而只有TNF-?和IL-6的mRNA表達(dá)不受TLR3反義探針的影響。有趣的是,脊髓COX2在正常組和胰腺炎組表達(dá)無(wú)顯著差異,TLR3反義探針也不影響其在脊髓的表達(dá)。 結(jié)論: 以上結(jié)果表明脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和其表達(dá)的TLR3參與了大鼠慢性胰腺炎模型的疼痛。慢性胰腺炎病理?xiàng)l件下脊髓的“TLR3-星形膠質(zhì)細(xì)胞- IL-1β/MCP-1”的正反饋通路可能為TLR參與慢性胰腺炎疼痛的機(jī)制,或許可以成為臨床慢性胰腺炎病人疼痛的緩解的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

正常組、偏手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組的隴染色和病理評(píng)分結(jié)呆

LAA對(duì)正常組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組的GFAP變化的影嗽
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R576

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2596449