【摘要】：研究背景及意義臨床研究中發(fā)現(xiàn),老年供肝受體移植術(shù)后的預(yù)后不佳與供肝的質(zhì)量不理想密切相關(guān),而肝細胞衰老是導(dǎo)致老年供肝質(zhì)量不理想的主要原因之一。衰老可以使哺乳動物組織穩(wěn)態(tài)失調(diào)和器官再生能力下降,主要是小幅度慢性應(yīng)激促進細胞損傷積累的結(jié)果。自噬在細胞衰老的過程中發(fā)揮了重要作用,自噬水平的降低是衰老的標志之一。探究肝臟衰老的機制并延緩肝細胞衰老,促進肝細胞再生對改善老年肝臟質(zhì)量,延緩肝臟相關(guān)的諸多疾病的進展具有十分重要的意義�？s宮素(Oxytocin,OT)是由下丘腦的視上核與室旁核合成,并且存儲于神經(jīng)垂體的一種激素。然而,近些年的研究發(fā)現(xiàn),除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外,機體很多外周器官,如心臟、子宮、胸腺和消化道等都能夠合成和釋放OT,部分細胞表面表達縮宮素受體(Oxytocin Receptor,OTR)。最新研究發(fā)現(xiàn),OT可促進缺血后的心肌的修復(fù)、成纖維干細胞及骨骼肌干細胞的分化和再生以及成年海馬神經(jīng)的再生。OT還可以通過改善其肌肉干細胞功能來恢復(fù)老齡小鼠的肌肉再生[1]。肝臟中是否也存在OTR,其激活是否可以延緩肝細胞衰老,仍未可知。本課題中我們主要研究肝臟中OTR的表達、分布特點及在肝細胞再生和延緩肝細胞衰老中的作用及機制。我們發(fā)現(xiàn)肝細胞表達OTR,在人的肝組織中其表達水平隨年齡增長而逐漸降低,在老齡鼠的肝組織中其表達水平較青年鼠也明顯降低。如此一致的是,人和小鼠血清中OT水平也隨年齡增加而明顯降低。利用肝細胞培養(yǎng)及小鼠肝類器官實驗等體外實驗發(fā)現(xiàn)OT可以促進肝細胞再生。進一步通過在體肝大部切除-肝再生模型及CC14引起的急性肝損傷病理模型研究發(fā)現(xiàn)OT促進老齡小鼠的肝再生,緩解CC14引起的急性肝損傷,促進修復(fù)。值得注意的是我們發(fā)現(xiàn)OT促進肝細胞自噬,不管是來自體外還是體內(nèi)研究。老齡小鼠肝組織自噬水平明顯低于青年小鼠,OT明顯提高老齡小鼠肝自噬水平而對青年小鼠沒有明顯作用,這與OT改善老年肝再生的結(jié)果一致。該結(jié)果提示OT可能通過誘導(dǎo)自噬來延緩肝細胞衰老,從而實現(xiàn)對老年供肝的肝移植后功能改善,為提高老年供肝質(zhì)量提供理論和實踐基礎(chǔ)。研究方法1.小鼠肝細胞株:實驗采用的細胞是AML12細胞(即小鼠肝實質(zhì)細胞),買自中國科學(xué)院的干細胞庫。AML12細胞培養(yǎng)的條件是在含有10%的FBS、1%的ITS Liquid Media Supplement(100x)、1%的雙抗(青霉素/鏈霉素)以及40ng/ml的Dexamethasone相混合的DMEM/F-12培養(yǎng)基中。需要37℃,5%C02的條件下,靜置培養(yǎng)于C02培養(yǎng)箱中。細胞在瓶中生長70%-80%密度后,進行下一步的細胞實驗。2.小鼠肝臟類器官模型:采用C57BL/6種類雄性小鼠,安樂處理后,取出并剪碎肝臟組織。用配制的含有0.3mg/ml Colllganase Ⅱ(膠原酶Ⅱ型)、0.3mg/ml Dispase Ⅱ的DMEM/F-12with15mMHEPSS消化液消化,此過程在37℃的恒溫搖床上進行,大約2h,共6次。經(jīng)70μm cell strainer過濾后,濾液再經(jīng)37μm Reversible Strainer過濾以及Advanced DMEM/F-12反向沖洗。290g,8℃低速水平冷凍離心機離心,將含有膽管片段的濾液富集。最后用Corning(?)Matrigel(?)Basement Membrane Matrix與收集的膽管片段均勻混合,50μl/孔,接種于24孔板內(nèi);約15min,基質(zhì)膠凝固,再加入HepatiCultTM Organoid Growth Medium(Mouse),500μl/孔。于溫度37℃和5%的二氧化碳的原代培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。3.動物建模:第一,采用2-3months和12months的C57BL/6雄性小鼠,建造肝臟大部切除-肝再生模型,隨機的分為了兩個組,分別為Control組和OT組,每組6只,OT處理采用皮下注射。第二,用12months的C57BL/6雄性小鼠,建造了 CC14急性肝損傷的模型,隨機分為四個組,分別是Oil(玉米油)、CC14(玉米油作為溶劑)、CCl4+OT(0.1mg/kg)、CCl4+OT(1mg/kg),實驗周期為2周。CCl4采用腹膜腔注射;OT采用皮下注射的方法進行。4.細胞模型檢測相關(guān)指標:對細胞所做的處理分為三部分,第一部分是用CCK-8試劑盒檢測不同濃度的OT對AML12細胞增殖的影響;第二部分是運用Western Blot檢測了 AML12細胞中OTR的表達,檢測不同濃度OT直接作用或先用雷帕霉素(rapamycin)預(yù)處理后對AML12細胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白的影響;第三部分是對AML12細胞轉(zhuǎn)染LC3 Lentivirus,利用免疫熒光檢測rapamycin預(yù)處理后不同濃度OT對自噬流的影響。5.小鼠肝臟類器官模型檢測指標:不同濃度OT處理,檢測在Oh、12h、36h、72h時間段內(nèi)與對照相比的類器官的數(shù)量和大小差異,以及對4個時間段進行拍照記錄;使用Western Blot檢測類器官中OTR的表達。6.動物模型檢測相關(guān)指標:在肝臟大部切除手術(shù)-肝再生模型中,肝臟切除3天后,小鼠取材,稱取剩余肝臟的重量,數(shù)據(jù)統(tǒng)計,計算與對照組相比OT處理組肝臟再生情況的這種差異。在CCl4-急性肝損傷模型中,利用了 HE染色,檢測不同處理組小鼠肝內(nèi)部形態(tài)的變化;用肝功專用檢測試劑盒,測定小鼠血清中AST及ALT的含量;利用免疫熒光對小鼠肝臟中的OTR的分布進行定位;利用Westem Blot檢測肝臟組織中OTR的表達,檢測不同處理組小鼠肝臟組織LC3Ⅱ/Ⅰ Beclin-1蛋白的變化。研究結(jié)果1.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)OTR在小鼠肝臟組織、AML12細胞以及小鼠肝臟類器官中均有表達。免疫熒光結(jié)果顯示OTR在肝組織的分布比較廣泛,主要存在于細胞膜上。2.不同月齡小鼠的OTR的表達不同,出現(xiàn)隨著年齡的增加,OTR的表達呈下降的趨勢。不同年齡的人的肝臟組織OTR的表達也隨著年齡的增加而下降。與此一致的是,人和小鼠血清樣本中OT水平也隨年齡增長顯著下降。3.OT促進AML12細胞的增殖,并且在10-7Mol/L下效果更加明顯。OT促進小鼠肝臟類器官的增長,在10-7Mol/L濃度下,效果顯著。4.肝臟切除的再生實驗中,OT明顯促進12月齡小鼠肝臟再生能力,而對2-3月齡小鼠沒有明顯作用。5.CCl4誘導(dǎo)的12月齡小鼠的急性肝損傷中,OT(0.1mg/kg)組與CCl4組相比小鼠的肝臟組織的破壞程度明顯減弱,炎性細胞浸潤程度降低,AST和ALT明顯降低,OT改善了 CCl4誘導(dǎo)的這種急性肝損傷。6.與OTR的表達特征相似,在2-3月齡和24月齡小鼠的肝臟標本中自噬標記物Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的水平,隨著年齡增大,明顯降低。相較對照組,OT的直接作用或經(jīng)rapamycin預(yù)處理后,OT明顯增加自噬標記物LC3Ⅱ/Ⅰ的比值,促進自噬流。在體實驗發(fā)現(xiàn)OT明顯提高肝臟大部切除和CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷老齡鼠肝臟組織的自噬水平,提示OT通過增強自噬水平來促進肝細胞再生,延緩肝細胞衰老。結(jié)論1.肝細胞中表達OTR,并且在人和小鼠的肝臟組織中OTR的表達以及血清中OT含量隨著年齡的增加而減少。2.OT可以促進AML12細胞的增殖以及小鼠肝臟類器官的生長。3.OT可以促進老齡小鼠的肝臟再生,而對年輕小鼠沒有作用。4.OT可以改善CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷。5.OT促進肝細胞自噬。
【圖文】：

圖２．不同年齡的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠肝臟組織和人的肝臟組織（結(jié)合圖ＩＤ）邋ＯＴＲ表逡逑達和血清中ＯＴ含量不同，隨著年齡的增加而降低逡逑（Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋檢測邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋和邋２４ｍｏｎｔｈｓ邋正常邋Ｃ５７ＢＬ／６邋小鼠邋ＯＴＲ邋蛋白表逡逑達量。（Ｂ）邋Ｉｍａｇｅ邋Ｊ分析ＯＴＲ條帶灰度值，結(jié)果顯示２４邋ｍｏｎｔｈｓ小鼠ＯＴＲ的表逡逑達量與邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋相比顯著下降。Ｖａｌｕｅ邋＝邋ｍｅａｎ土邋ＳＤ，ｎ＝４，＊＊表不與邋２－３ｍｏｎｔｈｓ逡逑正常邋Ｃ５７ＢＬ／６邋小鼠相比，尸＜０．０１。（Ｃ）邋Ｅｌｉｓａ邋檢測邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋和邋２４ｍｏｎｔｈｓ邋正常逡逑Ｃ５７ＢＬ／６小鼠血清中ＯＴ含量，，結(jié)果說明２４ｍｏｎｔｈｓ組ＯＴ含量與２－３ｍｏｎｔｈｓ相逡逑比明顯降低。＇＇／３１１＾邋＝邋１１＾１１±８０，１１５；５，＊表不與２１１１0１１１：］１３小鼠相比較，尸＜０．０５。逡逑（Ｄ邋Ｅｌｉｓａ檢測不同年齡段人血清中ＯＴ的含量，結(jié)果顯示人血清中ＯＴ含量隨著逡逑年齡增加逐漸降低。逡逑

圖６．肝臟大部切除－肝再生模型流程圖逡逑（Ａ）模擬青年小鼠和老齡鼠兩個年齡狀態(tài)，進行不同組的肝臟切除實驗，來觀逡逑察肝臟再生情況。實驗周期為７天，從實驗開始到小鼠取材，０Ｔ組都進行０Ｔ逡逑（Ｏ．ｌｍｇ／ｋｇ）的皮下注射。在第４天時開始進行肝臟切除手術(shù)，手術(shù)后３天（即逡逑肝臟切除后３天）對小鼠進行肝臟再生情況的檢測。（Ｂ）取材時，剩余部分肝逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬少締;呂東鶴;霍健;王姍姍;樸金花;;細胞衰老及在個體衰老中的作用[J];黑龍江醫(yī)藥科學(xué);2017年06期

2 喬夢楠;;間質(zhì)細胞衰老誘導(dǎo)上皮細胞癌變的研究進展[J];人人健康;2017年12期

3 吳霞;隋明;;細胞衰老與長壽[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2014年09期

4 ;《干細胞衰老與疾病》[J];細胞生物學(xué)雜志;2009年05期

5 ;《干細胞衰老與疾病》已出版[J];解剖科學(xué)進展;2009年04期

6 馬杰;章靜波;;干細胞衰老[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2007年06期

7 ;我國學(xué)者揭開人類細胞衰老之謎[J];發(fā)明與革新;2002年05期

8 童坦君;張宗玉;;細胞衰老過程中基因的結(jié)構(gòu)與功能變化[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;2002年07期

9 吳軍峰,童坦君;細胞衰老不能逆轉(zhuǎn)的經(jīng)典理論遇到了挑戰(zhàn)——“返老還童”有望?[J];生理科學(xué)進展;2000年04期

10 靜雨;;促進細胞衰老的基因[J];國外醫(yī)學(xué)情報;1999年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 吳緬;;長非編碼RNA調(diào)控細胞衰老新機制[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第十二屆全國會員代表大會暨2018年全國學(xué)術(shù)會議摘要集[C];2018年

2 張濤;海春旭;;氧化應(yīng)激在細胞衰老中的作用[A];中國活性氧生物學(xué)效應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文集（第一冊）[C];2011年

3 王元元;陳子興;岑建農(nóng);沈宏杰;何軍;梁建英;劉丹丹;姚利;;骨髓增生異常綜合征與骨髓細胞衰老增加的相關(guān)研究[A];第12屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

4 姜德建;袁瓊;昌蘭;李元建;;拉西地平抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老[A];2008年全國抗衰老與老年癡呆學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

5 梅穎;吳利春;劉朝奇;;高糖高脂誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老的實驗研究[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2016年全國學(xué)術(shù)會議論文集[C];2016年

6 黨女;孟愛民;;細胞衰老與Ⅱ型糖尿病[A];第十三屆中國實驗動物科學(xué)年會論文集[C];2017年

7 王玉全;李程程;樊飛躍;孟愛民;;線粒體與衰老[A];第十三屆中國實驗動物科學(xué)年會論文集[C];2017年

8 朱小飛;李電東;何琪楊;;小檗堿抗過氧化氫引起的細胞衰老的機制[A];2009全國抗衰老與老年癡呆學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

9 段建明;張宗玉;童坦君;;過氧化氫對DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因與細胞衰老的誘導(dǎo)作用[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

10 劉雪會;魏磊;董瓊?cè)~;劉紅蕾;汪小我;;高通量CRISPR文庫篩選細胞衰老的調(diào)控基因[A];中國生物工程學(xué)會第二屆青年科技論壇暨首屆青年工作委員會學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2017年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 唐聞佳 通訊員 袁蕙蕓;先讓癌細胞衰老再給予精準清除[N];文匯報;2019年

2 記者 劉霞;美科學(xué)家揭示細胞衰老機制[N];科技日報;2009年

3 趙冬紅;細胞衰老秘密[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2006年

4 記者 李京華;我國科學(xué)家解細胞衰老之謎[N];新華每日電訊;2002年

5 ;探尋人類細胞衰老之謎[N];中國醫(yī)藥報;2002年

6 李京華;初步揭開人類細胞衰老之謎[N];中藥報;2002年

7 新字;北大初步闡明人類細胞衰老原因[N];中國醫(yī)藥報;2002年

8 付東紅;北大發(fā)現(xiàn)P16基因在細胞衰老中的作用機理[N];中國醫(yī)藥報;2002年

9 周勇;北大醫(yī)學(xué)部深入開展細胞衰老研究[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 記者 王瀟雨;長壽基因如何影響干細胞衰老[N];健康報;2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 吳凡;SENEX基因通過觸發(fā)細胞衰老促進急性髓系白血病抗凋亡的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

2 劉嬌;STAT3在27-羥基膽固醇誘導(dǎo)神經(jīng)細胞衰老及斑馬魚神經(jīng)行為損傷中的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

3 金歡歡;姜黃素調(diào)控細胞衰老抗肝纖維化的機理研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2018年

4 周年;退變椎間盤終板軟骨細胞衰老及調(diào)控機制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

5 馬杰;全身照射引起小鼠Flk-1～+骨髓間充質(zhì)干細胞細胞衰老不相關(guān)的成骨潛能改變及其與骨骼和造血系統(tǒng)損傷的關(guān)系[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

6 孫月榴;姜黃素在人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老中的作用及機制研究[D];武漢大學(xué);2016年

7 張鐵輝;IL-6在垂體瘤細胞衰老中表達調(diào)控和作用機制研究[D];蘇州大學(xué);2014年

8 張楠楠;SIRT6蛋白調(diào)控器官及細胞衰老機制研究[D];清華大學(xué);2016年

9 馬沛卿;多種細胞衰老標記物在食管鱗狀細胞癌和癌前病變中的表達及臨床意義[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

10 伊桐凝;Aspirin抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老的作用及其機制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 耿可依;Adjudin在細胞衰老及其在腦缺血引起的星形膠質(zhì)細胞活化中的作用和機制探究[D];上海交通大學(xué);2017年

2 曹青;CD38缺失通過NAD~+/Sirt信號通路減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的心肌細胞衰老[D];南昌大學(xué);2019年

3 王美玲;TRPV1/SIRT1介導(dǎo)辣椒素抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老[D];南昌大學(xué);2019年

4 徐慧玲;menin調(diào)控細胞衰老的規(guī)律研究[D];廈門大學(xué);2018年

5 吳珠萍;A型核纖層蛋白C末端關(guān)鍵位點磷酸化及其與細胞衰老的關(guān)聯(lián)研究[D];深圳大學(xué);2018年

6 陸世華;HO-1下調(diào)導(dǎo)致細胞衰老及其表達調(diào)控的機制研究[D];山東大學(xué);2019年

7 付瑞;Th17/IL-17在小鼠血管內(nèi)皮細胞衰老進程中的變化及意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

8 王振;不同茶類抗UVB致表皮細胞衰老作用研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

9 羅丹;縮宮素通過誘導(dǎo)自噬延緩肝細胞衰老的機制研究[D];山東大學(xué);2019年

10 李瑞瑞;G蛋白偶聯(lián)受體激酶4（GRK4）誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE2細胞衰老及其抗腫瘤研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2019年

本文編號：2591948