【摘要】：研究背景及意義臨床研究中發(fā)現(xiàn),老年供肝受體移植術(shù)后的預(yù)后不佳與供肝的質(zhì)量不理想密切相關(guān),而肝細(xì)胞衰老是導(dǎo)致老年供肝質(zhì)量不理想的主要原因之一。衰老可以使哺乳動(dòng)物組織穩(wěn)態(tài)失調(diào)和器官再生能力下降,主要是小幅度慢性應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞損傷積累的結(jié)果。自噬在細(xì)胞衰老的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,自噬水平的降低是衰老的標(biāo)志之一。探究肝臟衰老的機(jī)制并延緩肝細(xì)胞衰老,促進(jìn)肝細(xì)胞再生對(duì)改善老年肝臟質(zhì)量,延緩肝臟相關(guān)的諸多疾病的進(jìn)展具有十分重要的意義�？s宮素(Oxytocin,OT)是由下丘腦的視上核與室旁核合成,并且存儲(chǔ)于神經(jīng)垂體的一種激素。然而,近些年的研究發(fā)現(xiàn),除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外,機(jī)體很多外周器官,如心臟、子宮、胸腺和消化道等都能夠合成和釋放OT,部分細(xì)胞表面表達(dá)縮宮素受體(Oxytocin Receptor,OTR)。最新研究發(fā)現(xiàn),OT可促進(jìn)缺血后的心肌的修復(fù)、成纖維干細(xì)胞及骨骼肌干細(xì)胞的分化和再生以及成年海馬神經(jīng)的再生。OT還可以通過(guò)改善其肌肉干細(xì)胞功能來(lái)恢復(fù)老齡小鼠的肌肉再生[1]。肝臟中是否也存在OTR,其激活是否可以延緩肝細(xì)胞衰老,仍未可知。本課題中我們主要研究肝臟中OTR的表達(dá)、分布特點(diǎn)及在肝細(xì)胞再生和延緩肝細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞表達(dá)OTR,在人的肝組織中其表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)而逐漸降低,在老齡鼠的肝組織中其表達(dá)水平較青年鼠也明顯降低。如此一致的是,人和小鼠血清中OT水平也隨年齡增加而明顯降低。利用肝細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠肝類器官實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OT可以促進(jìn)肝細(xì)胞再生。進(jìn)一步通過(guò)在體肝大部切除-肝再生模型及CC14引起的急性肝損傷病理模型研究發(fā)現(xiàn)OT促進(jìn)老齡小鼠的肝再生,緩解CC14引起的急性肝損傷,促進(jìn)修復(fù)。值得注意的是我們發(fā)現(xiàn)OT促進(jìn)肝細(xì)胞自噬,不管是來(lái)自體外還是體內(nèi)研究。老齡小鼠肝組織自噬水平明顯低于青年小鼠,OT明顯提高老齡小鼠肝自噬水平而對(duì)青年小鼠沒(méi)有明顯作用,這與OT改善老年肝再生的結(jié)果一致。該結(jié)果提示OT可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬來(lái)延緩肝細(xì)胞衰老,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)老年供肝的肝移植后功能改善,為提高老年供肝質(zhì)量提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。研究方法1.小鼠肝細(xì)胞株:實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞是AML12細(xì)胞(即小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞),買自中國(guó)科學(xué)院的干細(xì)胞庫(kù)。AML12細(xì)胞培養(yǎng)的條件是在含有10%的FBS、1%的ITS Liquid Media Supplement(100x)、1%的雙抗(青霉素/鏈霉素)以及40ng/ml的Dexamethasone相混合的DMEM/F-12培養(yǎng)基中。需要37℃,5%C02的條件下,靜置培養(yǎng)于C02培養(yǎng)箱中。細(xì)胞在瓶中生長(zhǎng)70%-80%密度后,進(jìn)行下一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。2.小鼠肝臟類器官模型:采用C57BL/6種類雄性小鼠,安樂(lè)處理后,取出并剪碎肝臟組織。用配制的含有0.3mg/ml Colllganase Ⅱ(膠原酶Ⅱ型)、0.3mg/ml Dispase Ⅱ的DMEM/F-12with15mMHEPSS消化液消化,此過(guò)程在37℃的恒溫?fù)u床上進(jìn)行,大約2h,共6次。經(jīng)70μm cell strainer過(guò)濾后,濾液再經(jīng)37μm Reversible Strainer過(guò)濾以及Advanced DMEM/F-12反向沖洗。290g,8℃低速水平冷凍離心機(jī)離心,將含有膽管片段的濾液富集。最后用Corning(?)Matrigel(?)Basement Membrane Matrix與收集的膽管片段均勻混合,50μl/孔,接種于24孔板內(nèi);約15min,基質(zhì)膠凝固,再加入HepatiCultTM Organoid Growth Medium(Mouse),500μl/孔。于溫度37℃和5%的二氧化碳的原代培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。3.動(dòng)物建模:第一,采用2-3months和12months的C57BL/6雄性小鼠,建造肝臟大部切除-肝再生模型,隨機(jī)的分為了兩個(gè)組,分別為Control組和OT組,每組6只,OT處理采用皮下注射。第二,用12months的C57BL/6雄性小鼠,建造了 CC14急性肝損傷的模型,隨機(jī)分為四個(gè)組,分別是Oil(玉米油)、CC14(玉米油作為溶劑)、CCl4+OT(0.1mg/kg)、CCl4+OT(1mg/kg),實(shí)驗(yàn)周期為2周。CCl4采用腹膜腔注射;OT采用皮下注射的方法進(jìn)行。4.細(xì)胞模型檢測(cè)相關(guān)指標(biāo):對(duì)細(xì)胞所做的處理分為三部分,第一部分是用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度的OT對(duì)AML12細(xì)胞增殖的影響;第二部分是運(yùn)用Western Blot檢測(cè)了 AML12細(xì)胞中OTR的表達(dá),檢測(cè)不同濃度OT直接作用或先用雷帕霉素(rapamycin)預(yù)處理后對(duì)AML12細(xì)胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白的影響;第三部分是對(duì)AML12細(xì)胞轉(zhuǎn)染LC3 Lentivirus,利用免疫熒光檢測(cè)rapamycin預(yù)處理后不同濃度OT對(duì)自噬流的影響。5.小鼠肝臟類器官模型檢測(cè)指標(biāo):不同濃度OT處理,檢測(cè)在Oh、12h、36h、72h時(shí)間段內(nèi)與對(duì)照相比的類器官的數(shù)量和大小差異,以及對(duì)4個(gè)時(shí)間段進(jìn)行拍照記錄;使用Western Blot檢測(cè)類器官中OTR的表達(dá)。6.動(dòng)物模型檢測(cè)相關(guān)指標(biāo):在肝臟大部切除手術(shù)-肝再生模型中,肝臟切除3天后,小鼠取材,稱取剩余肝臟的重量,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)算與對(duì)照組相比OT處理組肝臟再生情況的這種差異。在CCl4-急性肝損傷模型中,利用了 HE染色,檢測(cè)不同處理組小鼠肝內(nèi)部形態(tài)的變化;用肝功專用檢測(cè)試劑盒,測(cè)定小鼠血清中AST及ALT的含量;利用免疫熒光對(duì)小鼠肝臟中的OTR的分布進(jìn)行定位;利用Westem Blot檢測(cè)肝臟組織中OTR的表達(dá),檢測(cè)不同處理組小鼠肝臟組織LC3Ⅱ/Ⅰ Beclin-1蛋白的變化。研究結(jié)果1.Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OTR在小鼠肝臟組織、AML12細(xì)胞以及小鼠肝臟類器官中均有表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示OTR在肝組織的分布比較廣泛,主要存在于細(xì)胞膜上。2.不同月齡小鼠的OTR的表達(dá)不同,出現(xiàn)隨著年齡的增加,OTR的表達(dá)呈下降的趨勢(shì)。不同年齡的人的肝臟組織OTR的表達(dá)也隨著年齡的增加而下降。與此一致的是,人和小鼠血清樣本中OT水平也隨年齡增長(zhǎng)顯著下降。3.OT促進(jìn)AML12細(xì)胞的增殖,并且在10-7Mol/L下效果更加明顯。OT促進(jìn)小鼠肝臟類器官的增長(zhǎng),在10-7Mol/L濃度下,效果顯著。4.肝臟切除的再生實(shí)驗(yàn)中,OT明顯促進(jìn)12月齡小鼠肝臟再生能力,而對(duì)2-3月齡小鼠沒(méi)有明顯作用。5.CCl4誘導(dǎo)的12月齡小鼠的急性肝損傷中,OT(0.1mg/kg)組與CCl4組相比小鼠的肝臟組織的破壞程度明顯減弱,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低,AST和ALT明顯降低,OT改善了 CCl4誘導(dǎo)的這種急性肝損傷。6.與OTR的表達(dá)特征相似,在2-3月齡和24月齡小鼠的肝臟標(biāo)本中自噬標(biāo)記物Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的水平,隨著年齡增大,明顯降低。相較對(duì)照組,OT的直接作用或經(jīng)rapamycin預(yù)處理后,OT明顯增加自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ的比值,促進(jìn)自噬流。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OT明顯提高肝臟大部切除和CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷老齡鼠肝臟組織的自噬水平,提示OT通過(guò)增強(qiáng)自噬水平來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞再生,延緩肝細(xì)胞衰老。結(jié)論1.肝細(xì)胞中表達(dá)OTR,并且在人和小鼠的肝臟組織中OTR的表達(dá)以及血清中OT含量隨著年齡的增加而減少。2.OT可以促進(jìn)AML12細(xì)胞的增殖以及小鼠肝臟類器官的生長(zhǎng)。3.OT可以促進(jìn)老齡小鼠的肝臟再生,而對(duì)年輕小鼠沒(méi)有作用。4.OT可以改善CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷。5.OT促進(jìn)肝細(xì)胞自噬。
【圖文】：

圖２．不同年齡的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠肝臟組織和人的肝臟組織（結(jié)合圖ＩＤ）邋ＯＴＲ表逡逑達(dá)和血清中ＯＴ含量不同，隨著年齡的增加而降低逡逑（Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋檢測(cè)邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋和邋２４ｍｏｎｔｈｓ邋正常邋Ｃ５７ＢＬ／６邋小鼠邋ＯＴＲ邋蛋白表逡逑達(dá)量。（Ｂ）邋Ｉｍａｇｅ邋Ｊ分析ＯＴＲ條帶灰度值，結(jié)果顯示２４邋ｍｏｎｔｈｓ小鼠ＯＴＲ的表逡逑達(dá)量與邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋相比顯著下降。Ｖａｌｕｅ邋＝邋ｍｅａｎ土邋ＳＤ，ｎ＝４，＊＊表不與邋２－３ｍｏｎｔｈｓ逡逑正常邋Ｃ５７ＢＬ／６邋小鼠相比，尸＜０．０１。（Ｃ）邋Ｅｌｉｓａ邋檢測(cè)邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋和邋２４ｍｏｎｔｈｓ邋正常逡逑Ｃ５７ＢＬ／６小鼠血清中ＯＴ含量，，結(jié)果說(shuō)明２４ｍｏｎｔｈｓ組ＯＴ含量與２－３ｍｏｎｔｈｓ相逡逑比明顯降低。＇＇／３１１＾邋＝邋１１＾１１±８０，１１５；５，＊表不與２１１１0１１１：］１３小鼠相比較，尸＜０．０５。逡逑（Ｄ邋Ｅｌｉｓａ檢測(cè)不同年齡段人血清中ＯＴ的含量，結(jié)果顯示人血清中ＯＴ含量隨著逡逑年齡增加逐漸降低。逡逑

圖６．肝臟大部切除－肝再生模型流程圖逡逑（Ａ）模擬青年小鼠和老齡鼠兩個(gè)年齡狀態(tài)，進(jìn)行不同組的肝臟切除實(shí)驗(yàn)，來(lái)觀逡逑察肝臟再生情況。實(shí)驗(yàn)周期為７天，從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到小鼠取材，０Ｔ組都進(jìn)行０Ｔ逡逑（Ｏ．ｌｍｇ／ｋｇ）的皮下注射。在第４天時(shí)開(kāi)始進(jìn)行肝臟切除手術(shù)，手術(shù)后３天（即逡逑肝臟切除后３天）對(duì)小鼠進(jìn)行肝臟再生情況的檢測(cè)。（Ｂ）取材時(shí)，剩余部分肝逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2591948