本文關(guān)鍵詞：EGCG干預(yù)非酒精性脂肪肝大鼠代謝組學研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,由于人們生活水平的提高,高脂肪、高膽固醇飲食增加,使得非酒精性脂肪肝(NAFLD)患病率迅猛增高,現(xiàn)已成為危害人類健康的三大肝病之一。NAFLD病理過程復(fù)雜,涉及體內(nèi)多角度、多層次的生理生化過程,其致病機制尚未明確。到目前為止,非酒精性脂肪肝尚無治療的理想藥物,臨床上主要使用調(diào)血脂藥對其進行治療。但是這些藥物會加重脂質(zhì)在肝臟的沉積,容易引起和加重肝損傷,所以其安全性尚需進一步評價。因此近年來從植物資源中尋找高效、安全的天然產(chǎn)物來改善和治療非酒精性脂肪肝和代謝綜合征已成為研究的一大熱點。 EGCG是從綠茶葉中分離出來的一種具有多元酚羥基的兒茶素單體,是兒茶素中含量最高的單體化合物,大約占兒茶素總量的80%。因此也是綠茶的保健及藥理功能的主要活性成分。已有研究表明EGCG具有抗氧化、降血糖、保護心腦血管、抗肝纖維化、抗腫瘤等生物活性。另外有大量研究表明,多酚類化合物具有保肝護肝,降脂減肥的功效。但是對于其作用機理報道很少,已有的研究也是基于幾個生化指標小分子、基因或蛋白展開研究,這樣就很難全貌地了解兒茶素及EGCG的作用途徑,也很難解釋清楚這個復(fù)雜的致病及防治機理。 代謝組學具有整體性研究特點,能通過系統(tǒng)地檢測復(fù)雜的、動態(tài)的變化來辨識和解析被研究對象的生理病理狀態(tài),對于闡明生命復(fù)雜現(xiàn)象系統(tǒng)具有極為重要的意義。因此,本研究以高脂飼料誘導(dǎo)SD大鼠肝臟病變,建立非酒精性脂肪肝模型,然后通過EGCG干預(yù)模型大鼠,并利用代謝組學技術(shù)研究EGCG對高脂誘導(dǎo)的脂肪肝病的療效,從系統(tǒng)生物學角度全面考察EGCG對大鼠NAFLDD旨類代謝的影響,為茶葉資源的高值化利用、促進茶葉消費以及非酒精性脂肪肝和代謝綜合征的高效、安全的治療型藥物的開發(fā)提供科學依據(jù)。 主要研究結(jié)果如下： 1、EGCG干預(yù)NAFLD大鼠的藥效學研究。通過高脂飼料誘導(dǎo)SD大鼠肝臟病變,建立NAFLD模型,再用EGCG溶液對模型大鼠灌胃5周。第9周末處死大鼠后,測定其血液和肝臟的生化指標,并制作肝臟病理切片。結(jié)果顯示,與HCG組相比,MCG組血液中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GLU、MDA均升高,SOD降低。經(jīng)EGCG干預(yù)后,與MCG組相比,EIG組血液中除LDL-C仍略有上升外,其它指標均向HCG組方向變化。與HCG組相比,MCG組體重、肝濕重、肝系數(shù)、肝脾比都上升,肝勻漿液中TC、TG、MDA均升高,SOD降低。經(jīng)EGCG干預(yù)后,與MCG組相比,EIG組肝勻漿液中各項指標均逆向回落。肝切片光學顯微鏡檢查結(jié)果顯示,EIG組大鼠肝細胞脂肪變性的程度和脂肪顆粒沉積數(shù)目明顯減少。 2、EGCG干預(yù)NAFLD大鼠尿液代謝組學研究。通過UPLC-Q-TOF建立了尿液代謝組學分析方法,然后利用這個分析方法評價尿液的不同前處理方法,篩選出最佳前處理方法為：400μ L尿液+400μL冷乙腈+400μ L冷甲醇,渦旋混勻,冰浴5min,然后4℃下以14000rpm離心5min,取上清液。將各組樣品前處理后連續(xù)采集全部數(shù)據(jù)。然后對原始數(shù)據(jù)進行分子特征提取,二維數(shù)據(jù)矩陣批量導(dǎo)出,濾噪、峰對齊、峰匹配、標準化和歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理,再將數(shù)據(jù)分組、頻率過濾、顯著性分析、倍率過濾,然后通過MPP內(nèi)置的ID Browser功能對潛在的生物標記物檢索數(shù)據(jù)庫,最后返回MassHunter中驗證潛在差異化合物的真實性。驗證后真實的差異標志物如下：琥珀酸、α-酮戊二酸、馬尿酸、葡萄糖酸、辛酸、黃嘌呤、色氨酸、黃素單核苷酸、AMP、甜菜堿、輔酶R。最后根據(jù)差異標志物探索可能的代謝通路并篩選確定可能的生物標記物。 3、EGCG干預(yù)NAFLD大鼠肝臟代謝組學研究。首先建立肝勻漿液UPLC-Q-TOF代謝組學分析方法,通過建立的分析方法篩選出最佳的肝臟勻漿液前處理方法：以乙腈：雙重蒸餾水=8：2(V/V)為提取溶劑,在冰上先用組織勻漿機將肝組織搗碎,然后用玻璃勻漿管充分研磨,研磨液再放入超聲儀中超聲提取10min,最后將提取液在4℃下,14000rpm離心5min,取上清液,用雙重蒸餾水稀釋至乙腈含量為30%。所有樣品按篩選出前處理方法連續(xù)采集完所有數(shù)據(jù)。經(jīng)數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計分析后,共找出103個差異代謝物,其中在代謝通路中出現(xiàn)的化合物有26種。代謝通路上的差異化合物變化規(guī)律表明,MCG組肝細胞中外源性甘油酯類、膽固醇均增加,內(nèi)源性合成的TG增加,同時線粒體脂肪酸β-氧化功能減弱,導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂肪沉積,最終引發(fā)脂肪肝的發(fā)生。經(jīng)EGCG干預(yù)后,通路上很多內(nèi)源性代謝物出現(xiàn)逆向回落,表明EGCG通過抑制內(nèi)源性TG合成和增強脂肪酸β-氧化,從而達到降低肝細胞脂肪沉積,進而改善NAFLD的效果。
【關(guān)鍵詞】：非酒精性脂肪肝病 EGCG 代謝組學 超高壓液相色譜-串聯(lián)四級桿-飛行時間質(zhì)譜 代謝通路 模式識別技術(shù)
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-17
• 第一章 緒論17-29
• 1 非酒精性脂肪肝國內(nèi)外研究概況17-22
• 1.1 NAFLD的病因17-18
• 1.1.1 營養(yǎng)性因素17
• 1.1.2 內(nèi)分泌激素紊亂因素17-18
• 1.1.3 化學性致病因素18
• 1.1.4 生物性致病因素18
• 1.1.5 體重下降過快18
• 1.1.6 其他因素18
• 1.2 NAFLD的發(fā)病機制概述18-19
• 1.3 NAFLD的診斷技術(shù)19-22
• 1.3.1 常規(guī)生化指標檢測20
• 1.3.2 細胞因子檢測20-21
• 1.3.4 影像學檢查21
• 1.3.5 基因診斷21
• 1.3.6 肝活檢21-22
• 2 EGCG藥理研究概況22-24
• 2.1 抗氧化作用22
• 2.2 抗衰老作用22
• 2.3 類胰島素作用22-23
• 2.4 胰島素分泌增加,加強胰島素敏感性23
• 2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性23
• 2.6 抗腫瘤作用23
• 2.7 保護心腦血管活性23-24
• 2.8 抗紫外線輻射作用24
• 3 代謝組學研究概況24-27
• 3.1 代謝組學的概念和特點24-25
• 3.2 代謝組學的研究方法25
• 3.3 肝臟疾病中代謝組學的研究現(xiàn)狀25-27
• 4 研究目的與意義27
• 5 主要研究內(nèi)容及技術(shù)路線27-29
• 5.1 主要研究內(nèi)容27
• 5.2 技術(shù)路線27-29
• 第二章 EGCG干預(yù)非酒精性脂肪肝大鼠藥效學分析29-40
• 1 材料和方法29-32
• 1.1 材料29-30
• 1.1.1 實驗動物29
• 1.1.2 喂養(yǎng)飼料29-30
• 1.1.3 實驗樣品及配制方法30
• 1.2 藥品與試劑30
• 1.3 實驗儀器30
• 1.4 實驗方法30-32
• 1.4.1 非酒精性脂肪肝大鼠MCG的建立30
• 1.4.2 實驗動物分組及給藥方法30-31
• 1.4.3 樣本采集31
• 1.4.4 指標測定和切片制作31-32
• 1.4.5 數(shù)據(jù)處理32
• 2 結(jié)果與分析32-36
• 2.1 一般指標結(jié)果32-33
• 2.1.1 日常情況觀察32
• 2.1.2 各組大鼠的初末體重,肝濕重、脾濕重和肝指數(shù)、肝脾比值32-33
• 2.2 主要血清生化指標33-34
• 2.3 主要肝勻漿生化指標34-35
• 2.4 形態(tài)學指標35-36
• 2.4.1 肝臟肉眼觀察結(jié)果35
• 2.4.2 肝臟組織病理切片35-36
• 3 討論與結(jié)論36-40
• 3.1 EGCG能有效調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂和抑制肝臟中甘油三酯的合成37-38
• 3.2 EGCG能降低氧化應(yīng)激所致的脂質(zhì)過氧化損傷,改善肝臟炎癥反應(yīng)的程度38-39
• 3.3 結(jié)論39-40
• 第三章 EGCG干預(yù)非酒精性脂肪肝大鼠尿液代謝組學研究40-52
• 1 材料和方法40-43
• 1.1 試劑及儀器40
• 1.1.1 主要試劑40
• 1.1.2 主要儀器40
• 1.2 尿液的收集與保存40-41
• 1.3 尿液UPLC-ESI-Q-TOF檢測與分析41-43
• 1.3.1 尿液樣品前處理41
• 1.3.2 上樣樣品的制備方法41
• 1.3.3 尿液樣品UPLC-ESI-Q-TOF數(shù)據(jù)采集及分析41-42
• 1.3.4 數(shù)據(jù)處理42-43
• 2 結(jié)果與分析43-49
• 2.1 尿液代謝組學分析平臺的建立43
• 2.2 樣品不同制備方法的比較43-44
• 2.3 樣品數(shù)據(jù)模式識別分析和尿液中潛在生物標記物的確定及EGCG的影響44-48
• 2.4 潛在標志物二級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確認48-49
• 3 討論49-52
• 3.1 數(shù)據(jù)處理的流程及注意事項49-50
• 3.2 尿液中潛在生物標記物代謝通路的探討50-52
• 第四章 EGCG干預(yù)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟代謝組學研究52-69
• 1 材料和方法52-54
• 1.1 試劑及儀器52
• 1.1.1 主要試劑52
• 1.1.2 儀器設(shè)備52
• 1.2 肝臟組織采集52-53
• 1.3 肝組織勻漿液UPLC-ESI-Q-TOF檢測與分析53-54
• 1.3.1 肝組織勻漿液樣品前處理53
• 1.3.2 肝組織勻漿液樣品UPLC-ESI-Q-TOF數(shù)據(jù)采集及分析53-54
• 1.3.3 數(shù)據(jù)分析54
• 2 結(jié)果與分析54-66
• 2.1 肝組織勻漿樣品不同前處理方法的比較54
• 2.2 樣品數(shù)據(jù)模式識別分析和肝組織勻漿液中差異代謝物比較54-66
• 3 討論66-69
• 3.1 肝組織勻漿液中差異代謝物代謝通路的探討66-67
• 3.1.1 高脂飲食引起肝臟糖代謝通路的改變66
• 3.1.2 高脂飲食引起脂肪代謝的變化66-67
• 3.2 EGCG對代謝通路的影響67-69
• 全文總結(jié)69-70
• 1 本文主要研究結(jié)果69
• 1.1 成功建立了SD大鼠的NAFLD模型,并對EGCG干預(yù)效果進行了藥效學評價69
• 1.2 成功構(gòu)建了UPLC-Q-TOF尿液代謝組學方法,并找到與NAFLD密切相關(guān)的11個潛在生物標志物69
• 2 本文主要創(chuàng)新點69-70
• 2.1 首次用代謝組學的方法研究EGCG對NAFLD的干預(yù)作用69
• 2.2 首次從糖脂代謝變化途徑揭示EGCG干預(yù)NAFLD的機制69-70
• 參考文獻70-78
• 致謝78-79
• 作者簡歷79

【參考文獻】

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本文編號：257895