【摘要】：探明水通道蛋白在小鼠小腸中的表達(dá)及定位,為研究小腸水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的細(xì)胞和分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本文運(yùn)用RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測小鼠十二指腸、空腸和回腸中水通道蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,AQP3在小鼠空腸中存在基因和蛋白表達(dá),AQP4在小鼠回腸中存在基因和蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步明確這兩種水通道蛋白在小腸中的表達(dá)位置,通過免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)一步證實(shí)AQP3主要表達(dá)在小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞,而AQP4主要表達(dá)在小鼠回腸隱窩細(xì)胞基底膜。
【圖文】：

。1．2．4免疫組織化學(xué)4%多聚甲醛灌注小鼠，取小鼠空腸和回腸各約2cm，繼續(xù)用4%多聚甲醛固定標(biāo)本24h，石蠟包埋，6μm連續(xù)切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇再水化后，置入10mmol/L檸檬酸緩沖液(pH值6．0)微波修復(fù)抗原5min，室溫冷卻，PBS漂洗。10%非免疫羊血清封閉2h，分別用兔抗小鼠AQP3(1∶500稀釋)、AQP4抗體(1∶500稀釋)置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。多次沖洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育15min，PBS漂洗3次，DAB顯色，，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。2試驗(yàn)結(jié)果2．1總ＲNA質(zhì)量分析如圖1所示，分別從小鼠十二指腸、空腸和回腸組織中提取總ＲNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳結(jié)果顯示，28S、18S和5S三條泳帶均清晰、完整，且其亮度比基本符合2∶1，表明所提取的ＲNA未降解。測定并計(jì)算260nm和280nm紫外光吸收值OD260/OD280=1．9，表明提取的ＲNA純度較高，質(zhì)量可靠，可用于進(jìn)行ＲT-PCＲ試驗(yàn)。圖1總ＲNA凝膠電泳圖a:十二指腸;b:空腸;c:回腸2．2ＲT-PCＲ檢測小鼠小腸各段AQPs基因的表達(dá)應(yīng)用小鼠AQPs特異性引物對十二指腸、空腸和回腸組織進(jìn)行ＲT-PCＲ分析，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果如圖2所示，小鼠的空腸段存在AQP3基因表達(dá)，小鼠的回腸段存在AQP4基因表達(dá)。而小鼠的十二指腸段，沒有檢測到水通道蛋白基因的表達(dá)。圖2ＲT-PCＲ檢測AQPs基因在小鼠十二指腸、空腸、回腸中的表達(dá)M:DL-2000Marker;A:β-actin為內(nèi)參;O:AQPO;1:AQP1;2:AQP2;3:AQP3;4:AQP4;5:AQP5;6:AQP6;7:AQP7;8:AQP8;9:AQP9;10:AQP10;11:AQP11;12:AQP122．3WesternBlot檢測水通道蛋白AQP3和AQP4的106

荊嘁直鶇有∈?十二指腸、空腸和回腸組織中提取總ＲNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳結(jié)果顯示，28S、18S和5S三條泳帶均清晰、完整，且其亮度比基本符合2∶1，表明所提取的ＲNA未降解。測定并計(jì)算260nm和280nm紫外光吸收值OD260/OD280=1．9，表明提取的ＲNA純度較高，質(zhì)量可靠，可用于進(jìn)行ＲT-PCＲ試驗(yàn)。圖1總ＲNA凝膠電泳圖a:十二指腸;b:空腸;c:回腸2．2ＲT-PCＲ檢測小鼠小腸各段AQPs基因的表達(dá)應(yīng)用小鼠AQPs特異性引物對十二指腸、空腸和回腸組織進(jìn)行ＲT-PCＲ分析，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果如圖2所示，小鼠的空腸段存在AQP3基因表達(dá)，小鼠的回腸段存在AQP4基因表達(dá)。而小鼠的十二指腸段，沒有檢測到水通道蛋白基因的表達(dá)。圖2ＲT-PCＲ檢測AQPs基因在小鼠十二指腸、空腸、回腸中的表達(dá)M:DL-2000Marker;A:β-actin為內(nèi)參;O:AQPO;1:AQP1;2:AQP2;3:AQP3;4:AQP4;5:AQP5;6:AQP6;7:AQP7;8:AQP8;9:AQP9;10:AQP10;11:AQP11;12:AQP122．3WesternBlot檢測水通道蛋白AQP3和AQP4的106

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