【摘要】：目的:為了獲得高純度的眼鏡蛇毒細胞毒素-4N(Cytotoxin-4N,CTX-4N),探索眼鏡蛇毒中細胞毒素-4N對大鼠肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用和CTX-4N通過ERK信號通路對HSC-T6細胞凋亡的影響,從而闡明CTX-4N通過ERK信號通路誘導肝星狀細胞凋亡的機制。方法:采用DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽離子交換柱結合的方法對眼鏡蛇毒蛋白進行分離純化。采用HSC-T6增殖抑制實驗對每一步分離后的各峰蛋白CTX-4N進行活性檢測。收集活性最強的蛋白峰,在用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定其純度。采用蛋白質譜法鑒定其成分及分子量大小。用CCK-8方法檢測不同濃度的CTX-4N對HSC-T6的增殖抑制作用。采用流式細胞術檢測CTX-4N對HSC-T6細胞凋亡的影響。采用Western-Blot檢測CTX4-N作用HSC-T6細胞不同時間后,ERK信號通路中ERK1/2的磷酸化水平的變化;以及在加入抑制劑PD98059處理HSC-T6細胞后,ERK信號通路中ERK1/2磷酸化水平的變化。抑制劑實驗分組:空白對照組、CTX-4N組、抑制劑組和CTX-4N+抑制劑組。結果:通過DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽離子交換柱分離純化后得到一個電泳純度的蛋白,蛋白質譜鑒定為CTX-4N,分子量約為9.605 KDa。不同濃度的CTX-4N對HSC-T6細胞具有增殖抑制作用,隨著濃度的增加而增強,最小抑制濃度為2μg/mL,呈劑量-效應關系,IC50為(12.836±0.045)μg/mL。不同濃度的CTX-4N對HSC-T6細胞的凋亡作用隨著濃度的增加而增強,且誘導HSC-T6凋亡的最小濃度為4μg/mL。以4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6不同時間后,各時間點的ERK1/2蛋白表達沒有變化,而磷酸化ERK1/2蛋白的表達一開始是隨著作用時間的延長而表達增加,作用10min后磷酸化ERK1/2表達水平最高,隨后就開始降低,到60min后其表達低于對照組(P㩳0.05)。以10μmol/L的PD98059和4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6細胞后,ERK1/2蛋白的表達沒有發(fā)生改變,而可以顯著的抑制磷酸化ERK1/2的表達。結論:廣西眼鏡蛇毒通過DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽離子交換柱分離純化獲得電泳純度的CTX-4N。CTX-4N能使HSC-T6細胞發(fā)生凋亡作用,對ERK信號通路中的磷酸化ERK1/2表達具有抑制作用,因此,CTX-4N可能通過ERK信號通路誘導HSC-T6凋亡,來干預肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2566313