【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinaseinteracting proteins2，GIT2)是一種多結(jié)構(gòu)域的信號支架蛋白，屬于ARF GTPase-激活蛋白(ARF GTPase-activating protein，Arf GAPs)家族。Git2基因敲除小鼠表現(xiàn)為骨髓外造血、脾腫大、髓性粒細胞增加、肺部淋巴細胞浸潤增加、對病原體感染的敏感性增加等多種免疫缺陷癥狀。大量研究表明，GIT2與免疫系統(tǒng)有著密切的關(guān)系：GIT2缺失可導(dǎo)致中性粒細胞的細胞趨化方向感應(yīng)受損和超氧化物的過量產(chǎn)生；在TCR轉(zhuǎn)基因Git2-/-小鼠胸腺中，CD4+CD8+T細胞向CD4+CD8-T細胞的發(fā)育過程受損，導(dǎo)致CD4+CD8-T細胞比例降低。這些都提示GIT2在機體的天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中具有重要功能。此外還有證據(jù)表明，GIT2能與αPIX、PAK1形成三分子復(fù)合體，在TCR通路中以獨立于LAT、SLP-76、Nck和Rac的TCR調(diào)節(jié)替代途徑激活PAK1，并由αPIX將PAK1靶定位在免疫突觸發(fā)揮作用。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Git2基因敲除小鼠能夠抵抗刀豆蛋白A(Concanavalin A，，ConA)誘發(fā)的急性免疫性肝損傷，因此我們推測GIT2可能參與調(diào)節(jié)免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程。 我們分離Git2敲除小鼠脾臟單個核細胞，并分選出CD3+和CD4+T細胞，體外刺激后檢測細胞的增殖及細胞因子分泌情況；針對Con A主要作用于T細胞受體的機制，研究GIT2缺失對TCR通路活化的影響，包括信號分子的磷酸化、細胞骨架重塑、免疫突觸的形成以及Rac/Cdc42小GTPase活性。結(jié)果表明，GIT2缺失降低T淋巴細胞體外增殖和細胞因子的分泌；GIT2缺失不影響經(jīng)典TCR通路的活化，但影響GIT2-αPIX-PAK1三聚體的形成，并且F-actin在免疫突觸部位的聚集及帽型結(jié)構(gòu)的形成受損。此外，我們還發(fā)現(xiàn)GIT2缺失降低了αPIX的穩(wěn)定性，并導(dǎo)致其泛素化降解，PAK1抑制劑IPA-3能夠抑制野生型小鼠T淋巴細胞的增殖與活化。由此我們推斷，由于GIT2的缺失導(dǎo)致αPIX的蛋白水平下調(diào)，致使GIT2-αPIX-PAK1介導(dǎo)的TCR非經(jīng)典途徑受損，PAK1不能被有效磷酸化，減弱免疫性肝損傷中T細胞的活化和細胞因子分泌，而表現(xiàn)出保護作用。 此外，由于GIT2在損傷的肝實質(zhì)細胞中高表達，我們對Con A誘導(dǎo)的Git2+/+和Git2-/-小鼠急性肝損傷的肝組織中的重要分子表達變化進行了研究，包括信號通路的變化、效應(yīng)基因的表達變化等。結(jié)果表明在Con A致?lián)p的Git2-/-小鼠肝臟中NF-κB通路活化增加，ERK和Smad3的磷酸化受到抑制，JNK磷酸化提前但持續(xù)時間較短。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)GIT2可通過募集A20影響NEMO的泛素化發(fā)揮其對NF-κB的負調(diào)控作用。因此我們利用Real-Time PCR技術(shù)研究了Con A致?lián)p小鼠肝組織中GIT2對NF-κB通路下游靶基因的表達變化，結(jié)果表明GIT2缺失導(dǎo)致NF-κB通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平增加。前期酵母雙雜交篩庫中我們發(fā)現(xiàn)Smad3是GIT2的一個候選相互作用分子，并且已有研究表明，Smad3敲除小鼠能夠免受Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷，因此我們用免疫共沉淀驗證了GIT2與Smad3的相互作用，并發(fā)現(xiàn)GIT2可增加Smad3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。 本研究從T淋巴細胞和肝實質(zhì)細胞兩個方面揭示了GIT2在免疫性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中不同的作用機制。在T淋巴細胞中，GIT2與αPIX、PAK1形成三聚體，參與介導(dǎo)TCR的非經(jīng)典途徑，活化PAK1并最終導(dǎo)致肝臟中T細胞的活化和細胞因子分泌，介導(dǎo)ConA誘導(dǎo)的肝損傷。在肝實質(zhì)細胞中，GIT2抑制NF-κB的活化，參與促進肝實質(zhì)細胞凋亡；此外GIT2能夠與Smad3相互作用調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，也可能參與調(diào)節(jié)ConA致傷過程，但其具體作用機制仍需進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

2 ;Immune mechanisms of Concanavalin A model of autoimmune hepatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2012年02期

本文編號：2562387