【摘要】：G蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinaseinteracting proteins2，GIT2)是一種多結構域的信號支架蛋白，屬于ARF GTPase-激活蛋白(ARF GTPase-activating protein，Arf GAPs)家族。Git2基因敲除小鼠表現為骨髓外造血、脾腫大、髓性粒細胞增加、肺部淋巴細胞浸潤增加、對病原體感染的敏感性增加等多種免疫缺陷癥狀。大量研究表明，GIT2與免疫系統(tǒng)有著密切的關系：GIT2缺失可導致中性粒細胞的細胞趨化方向感應受損和超氧化物的過量產生；在TCR轉基因Git2-/-小鼠胸腺中，CD4+CD8+T細胞向CD4+CD8-T細胞的發(fā)育過程受損，導致CD4+CD8-T細胞比例降低。這些都提示GIT2在機體的天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中具有重要功能。此外還有證據表明，GIT2能與αPIX、PAK1形成三分子復合體，在TCR通路中以獨立于LAT、SLP-76、Nck和Rac的TCR調節(jié)替代途徑激活PAK1，并由αPIX將PAK1靶定位在免疫突觸發(fā)揮作用。實驗室前期研究發(fā)現Git2基因敲除小鼠能夠抵抗刀豆蛋白A(Concanavalin A，，ConA)誘發(fā)的急性免疫性肝損傷，因此我們推測GIT2可能參與調節(jié)免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程。 我們分離Git2敲除小鼠脾臟單個核細胞，并分選出CD3+和CD4+T細胞，體外刺激后檢測細胞的增殖及細胞因子分泌情況；針對Con A主要作用于T細胞受體的機制，研究GIT2缺失對TCR通路活化的影響，包括信號分子的磷酸化、細胞骨架重塑、免疫突觸的形成以及Rac/Cdc42小GTPase活性。結果表明，GIT2缺失降低T淋巴細胞體外增殖和細胞因子的分泌；GIT2缺失不影響經典TCR通路的活化，但影響GIT2-αPIX-PAK1三聚體的形成，并且F-actin在免疫突觸部位的聚集及帽型結構的形成受損。此外，我們還發(fā)現GIT2缺失降低了αPIX的穩(wěn)定性，并導致其泛素化降解，PAK1抑制劑IPA-3能夠抑制野生型小鼠T淋巴細胞的增殖與活化。由此我們推斷，由于GIT2的缺失導致αPIX的蛋白水平下調，致使GIT2-αPIX-PAK1介導的TCR非經典途徑受損，PAK1不能被有效磷酸化，減弱免疫性肝損傷中T細胞的活化和細胞因子分泌，而表現出保護作用。 此外，由于GIT2在損傷的肝實質細胞中高表達，我們對Con A誘導的Git2+/+和Git2-/-小鼠急性肝損傷的肝組織中的重要分子表達變化進行了研究，包括信號通路的變化、效應基因的表達變化等。結果表明在Con A致損的Git2-/-小鼠肝臟中NF-κB通路活化增加，ERK和Smad3的磷酸化受到抑制，JNK磷酸化提前但持續(xù)時間較短。實驗室前期研究發(fā)現GIT2可通過募集A20影響NEMO的泛素化發(fā)揮其對NF-κB的負調控作用。因此我們利用Real-Time PCR技術研究了Con A致損小鼠肝組織中GIT2對NF-κB通路下游靶基因的表達變化，結果表明GIT2缺失導致NF-κB通路下游靶基因的轉錄水平增加。前期酵母雙雜交篩庫中我們發(fā)現Smad3是GIT2的一個候選相互作用分子，并且已有研究表明，Smad3敲除小鼠能夠免受Con A誘導的免疫性肝損傷，因此我們用免疫共沉淀驗證了GIT2與Smad3的相互作用，并發(fā)現GIT2可增加Smad3介導的轉錄活性。 本研究從T淋巴細胞和肝實質細胞兩個方面揭示了GIT2在免疫性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中不同的作用機制。在T淋巴細胞中，GIT2與αPIX、PAK1形成三聚體，參與介導TCR的非經典途徑，活化PAK1并最終導致肝臟中T細胞的活化和細胞因子分泌，介導ConA誘導的肝損傷。在肝實質細胞中，GIT2抑制NF-κB的活化，參與促進肝實質細胞凋亡；此外GIT2能夠與Smad3相互作用調節(jié)其轉錄活性，也可能參與調節(jié)ConA致傷過程，但其具體作用機制仍需進一步研究。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

2 ;Immune mechanisms of Concanavalin A model of autoimmune hepatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2012年02期

本文編號：2562387