【摘要】：【研究背景】肝纖維化是肝臟長(zhǎng)期遭受慢性損傷因素刺激后所發(fā)生的以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)異常沉積為主要特征的病理變化。肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中ECM主要由活化的肌成纖維母細(xì)胞產(chǎn)生,但目前針對(duì)肌成纖維母細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議。肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cells,LSECs)是肝臟組織特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞,其特異性主要表現(xiàn)為細(xì)胞表面具有豐富的窗孔結(jié)構(gòu)以及血管內(nèi)皮基底膜的缺失。雖然肝血竇特異性周細(xì)胞——星型細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)目前被認(rèn)為是肌成纖維母細(xì)胞的主要貢獻(xiàn)者,但既往文獻(xiàn)報(bào)道血管內(nèi)皮細(xì)胞也能夠通過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Endothelial Mesenchymal Transition,EnMT)過(guò)程轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細(xì)胞并參與到多種組織器官的纖維化進(jìn)展當(dāng)中,而LSECs作為肝臟組織中數(shù)量最大的一類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否具有轉(zhuǎn)分化為肌成纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞的能力并參與促進(jìn)肝纖維化,是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。Notch信號(hào)通路對(duì)血管發(fā)育、血管新生、血管功能和組織器官穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。既往文獻(xiàn)表明,Notch信號(hào)是血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EnMT的始動(dòng)因素之一,并且Notch信號(hào)能夠通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EnMT而參與心臟的發(fā)育過(guò)程。包括我們課題組在內(nèi)的前期研究發(fā)現(xiàn),血管特異性Notch信號(hào)在維持肝臟血管正常結(jié)構(gòu)、血管旁分泌功能和急性肝損傷后的血管重塑過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵角色。而在慢性損傷因素導(dǎo)致的肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,LSECs特異性的Notch信號(hào)如何變化,以及Notch信號(hào)是否會(huì)通過(guò)調(diào)控LSECs的EnMT參與纖維化的發(fā)生發(fā)展,尚不清楚�！灸康摹棵鞔_在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,LSECs是否會(huì)通過(guò)EnMT轉(zhuǎn)分化為肌成纖維母細(xì)胞樣的細(xì)胞而參與肝纖維化;闡明LSECs特異性Notch信號(hào)是否在其EnMT過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用�！痉椒ā�1.分離提取小鼠原代LSECs并鑒定,在其體外培養(yǎng)過(guò)程中,觀察毛細(xì)血管化的(Capilarized)LSECs是否存在EnMT樣轉(zhuǎn)變。2.建立小鼠肝纖維化模型,通過(guò)免疫熒光染色觀察肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中LSECs與間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物的共定位情況。3.分離提取小鼠肝纖維化不同階段的LSECs,在mRNA和蛋白水平檢測(cè)纖維化過(guò)程中LSECs特異性EnMT標(biāo)志物的變化情況。4.通過(guò)遺傳示蹤小鼠模型驗(yàn)證肝纖維化病理過(guò)程中LSECs的EnMT現(xiàn)象,并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)在單細(xì)胞層面證實(shí)LSECs能夠作為肌成纖維母細(xì)胞的前體細(xì)胞之一,在纖維化過(guò)程中獲得肌成纖維母細(xì)胞樣的特征。5.分離靜息和纖維化條件下的HSCs和LSECs,通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法從基因表達(dá)譜層面驗(yàn)證LSECs在EnMT發(fā)生過(guò)程中獲得了肌成纖維母細(xì)胞樣特征,并對(duì)比其與傳統(tǒng)HSCs來(lái)源肌成纖維母細(xì)胞的異同。6.通過(guò)免疫熒光染色等技術(shù),在臨床肝硬化樣本中對(duì)LSECs的EnMT現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。7.通過(guò)mRNA和蛋白水平的檢測(cè),觀察纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中LSECs特異性Notch信號(hào)的變化情況。8.構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞特異性Notch信號(hào)激活/阻斷小鼠模型,觀察內(nèi)皮特異性Notch信號(hào)激活/阻斷對(duì)小鼠肝纖維化、LSECs毛細(xì)血管化以及LSECs EnMT的影響。9.在體外水平,通過(guò)使用Notch信號(hào)阻斷劑阻斷培養(yǎng)過(guò)程中LSECs的Notch信號(hào),觀察其對(duì)體外LSECs自發(fā)性EnMT的挽救作用。10.在體內(nèi)外水平,通過(guò)使用可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(Soluble Guanylate Cyclase,sGC)激動(dòng)劑,抑制LSECs在體外培養(yǎng)和體內(nèi)肝纖維化過(guò)程中發(fā)生的毛細(xì)血管化,觀察LSECs的成熟分化狀態(tài)對(duì)EnMT的影響,初步探索LSECs的EnMT與毛細(xì)血管化現(xiàn)象的相關(guān)性�！窘Y(jié)果】1.我們通過(guò)免疫磁珠分選(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)的方法成功從小鼠肝臟分離提取出原代LSECs,經(jīng)FACS驗(yàn)證所提取的LSECs 99.7%為VEGFR3~+CD34~-,體外培養(yǎng)貼壁的LSECs光鏡下形態(tài)均一,細(xì)胞具有吞噬甲醛化白蛋白(Formaldehyde-treated Serum Albumin,FSA)和乙�；兔芏戎鞍�(Acetyl Low Density Lipoprotein,acLDL)的能力,掃描電鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)觀察到細(xì)胞表面擁有特征性的窗孔結(jié)構(gòu)。在LSECs體外培養(yǎng)過(guò)程中我們觀察到毛細(xì)血管化的LSECs逐漸呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形間質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài),通過(guò)mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管化的LSECs表達(dá)出明顯的間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物——如α平滑肌動(dòng)蛋白(alpha Smooth Muscle Actin,a-SMA)、平滑肌22α(Smooth Muscle 22 alpha,Sm22)和I型膠原(Type I Collagen,Col-1)等。2.我們?cè)谝吧鶦57小鼠上建立了CCl_4肝纖維化模型,SEM下可見(jiàn)LSECs在損傷早期、膠原纖維出現(xiàn)之前即發(fā)生毛細(xì)血管化,與文獻(xiàn)報(bào)道相同。通過(guò)免疫熒光染色觀察到,在纖維瘢痕沉積的匯管區(qū)以外區(qū)域,存在明顯LSECs與肌成纖維母細(xì)胞標(biāo)志物a-SMA、Sm22和Col-1的共定位,并且這種共定位現(xiàn)象在靜息狀態(tài)下就存在,而且在肝損傷早期便會(huì)大量出現(xiàn)。此外,我們?cè)谀懝芙Y(jié)扎(Bile Duct Ligation,BDL)肝纖維化模型中也驗(yàn)證了這種共定位現(xiàn)象。3.進(jìn)一步我們分離了纖維化不同時(shí)間點(diǎn)的LSECs,通過(guò)mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè),證實(shí)了隨著纖維化的進(jìn)展,LSECs中的肌成纖維母細(xì)胞樣標(biāo)志物出現(xiàn)明顯升高,并且這些間質(zhì)樣標(biāo)志物在靜息態(tài)LSECs中便能夠被檢測(cè)到,而在肝損傷發(fā)生后表達(dá)立刻升高。4.為進(jìn)一步明確纖維化過(guò)程中LSECs的EnMT現(xiàn)象,我們構(gòu)建了Cdh5~(Cre)ROSA-YFP~(stop/flox)遺傳示蹤小鼠,在此小鼠的基礎(chǔ)上建立CCl_4和BDL肝纖維化模型,通過(guò)激光共聚焦同樣追蹤到Y(jié)FP+LSECs與肌成纖維母細(xì)胞樣標(biāo)志物的共定位。隨后我們分離了對(duì)照組和纖維化組Cdh5~(Cre)ROSA-YFP~(stop/flox)小鼠的LSECs,通過(guò)FACS檢測(cè),我們?cè)趩渭?xì)胞水平證實(shí)了靜息態(tài)YFP~+LSECs作為一種具有肌成纖維母細(xì)胞樣特征的前體細(xì)胞,在肝纖維化時(shí)能夠發(fā)生EnMT。5.將靜息和纖維化條件下的HSCs和LSECs進(jìn)行分離后測(cè)序,在表達(dá)譜層面,通過(guò)主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)我們發(fā)現(xiàn)LSECs通過(guò)EnMT途徑轉(zhuǎn)變而來(lái)的肌成纖維母細(xì)胞與傳統(tǒng)意義上HSCs活化而來(lái)的肌成纖維母細(xì)胞屬于不同的細(xì)胞亞群,但兩者在肌成纖維母細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)模式上存在相似性。6.通過(guò)對(duì)臨床肝硬化患者硬化肝臟標(biāo)本的免疫熒光染色,我們同樣證實(shí)了人LSECs在肝硬化背景下也能夠發(fā)生EnMT,并且天狼猩紅染色結(jié)果提示——發(fā)生EnMT的LSECs可能與血竇性纖維化關(guān)系更密切。7.在mRNA水平和蛋白水平,我們通過(guò)對(duì)纖維化不同時(shí)間點(diǎn)LSECs Notch信號(hào)下游靶分子Hes1和Hey1的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LSECs中的Notch信號(hào)在損傷早期被抑制,但隨著損傷因素的持續(xù)刺激,LSECs中的Notch信號(hào)被持續(xù)活化,提示Notch信號(hào)的激活有可能參與LSECs的EnMT過(guò)程。8.為進(jìn)一步研究Notch信號(hào)在LSECs EnMT中的作用,我們構(gòu)建了Cdh5~(CreERT) ROSA26-N1ICD~(stop/flox)內(nèi)皮特異性Notch信號(hào)激活轉(zhuǎn)基因小鼠和Cdh5~(Cre)ERTRBP-j~(flox/flox)內(nèi)皮特異性Notch信號(hào)阻斷轉(zhuǎn)基因小鼠,通過(guò)建立CCl_4肝纖維化模型,我們發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞中激活Notch信號(hào)加重了小鼠的肝纖維化、肝血竇毛細(xì)血管化和LSECs的EnMT;相反,內(nèi)皮細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)能夠減弱肝血竇毛細(xì)血管化和LSECs的EnMT,但其并未能顯著減輕肝纖維化程度。9.在體外培養(yǎng)的LSECs中,我們通過(guò)GSI阻斷Notch信號(hào)后發(fā)現(xiàn),Notch阻斷能夠挽救LSECs體外培養(yǎng)過(guò)程中的自發(fā)性EnMT現(xiàn)象,表現(xiàn)為細(xì)胞的間質(zhì)樣形態(tài)變化被抑制以及肌成纖維母細(xì)胞樣標(biāo)志物表達(dá)的減少。10.為闡明LSECs的EnMT與毛細(xì)血管化的關(guān)系,我們對(duì)體外培養(yǎng)的LSECs給予sGC激動(dòng)劑YC-1處理后發(fā)現(xiàn),YC-1在抑制LSECs發(fā)生毛細(xì)血管化的同時(shí),也抑制了LSECs自發(fā)性EnMT的發(fā)生;同時(shí)YC-1在體內(nèi)能夠減輕小鼠的肝纖維化程度并改善肝損傷。以上結(jié)果提示EnMT與毛細(xì)血管化有可能是LSECs的同一病理過(guò)程在不同層面的定義,阻止LSECs EnMT的發(fā)生是治療肝纖維化的有效手段之一�！窘Y(jié)論】1.LSECs作為一種潛在的肌成纖維母細(xì)胞的前體細(xì)胞,在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中能夠通過(guò)EnMT轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維母細(xì)胞。2.Notch信號(hào)通路參與調(diào)控了LSECs的EnMT病理過(guò)程。3.LSECs的EnMT與毛細(xì)血管化可能是同一種病理變化,阻斷LSECs發(fā)生EnMT有可能成為抑制肝纖維化的有效手段。
【圖文】：

肝小葉結(jié)構(gòu)示意圖

圖 1. 肝小葉結(jié)構(gòu)示意圖圖 2. 肝血竇結(jié)構(gòu)示意圖2. 肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞LSECs 是肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞群中數(shù)量最大的一群細(xì)胞，約占整個(gè)肝臟體積的 3%，所有肝臟細(xì)胞數(shù)量的 15%-20%，，而在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量中占 50%以上，是構(gòu)成肝血竇
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2


本文編號(hào)：2550776