【摘要】：目的:腸道微生物種類(lèi)繁多,數(shù)目龐大,其中細(xì)菌總量可占微生物總數(shù)的99%以上。這些在腸道內(nèi)定植、復(fù)雜多樣的細(xì)菌就被稱(chēng)之為腸道菌群。腸道菌群目前被認(rèn)為是人類(lèi)后天獲得的一種重要器官。腸道菌群在宿主生理學(xué)中可起多重關(guān)鍵作用,包括輔助宿主消化吸收、調(diào)節(jié)能量吸收與代謝、參與機(jī)體免疫系統(tǒng)活化等。已知腸道菌群可促進(jìn)宿主胃腸道運(yùn)動(dòng),可能通過(guò)與胃腸組織中的免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用而發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其作用途徑與機(jī)制尚不明確。5-羥色胺(5-HT)不僅作為神經(jīng)遞質(zhì)而且在胃腸組織中作為免疫系統(tǒng)的介質(zhì),在調(diào)節(jié)胃腸道免疫系統(tǒng)和胃腸運(yùn)動(dòng)中可能起著關(guān)鍵作用。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是由腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的腸降血糖素激素,其生理學(xué)功能必須通過(guò)相應(yīng)GLP-1受體的介導(dǎo)才能產(chǎn)生作用,不僅調(diào)節(jié)葡萄糖體內(nèi)平衡,而且調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)。因此本研究擬以無(wú)菌小鼠為研究對(duì)象,探討腸道菌群如何影響胃腸蠕動(dòng),運(yùn)用糞菌移植建立腸道運(yùn)動(dòng)改變的小鼠模型從5-HT表達(dá)和巨噬細(xì)胞行為之間的關(guān)聯(lián)及GLP-1/GLP-1受體表達(dá)水平探索腸道菌群影響胃腸運(yùn)動(dòng)的機(jī)制。第一部分糞菌移植對(duì)無(wú)菌小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的影響方法:我們將6周齡的ICR野生型小鼠和6周齡ICR無(wú)菌小鼠分為兩組:野生型組給予正常飲食飲水;糞菌移植組于無(wú)菌小鼠到達(dá)當(dāng)時(shí)即刻以灌胃的方式給予SPF級(jí)別ICR野生型小鼠新鮮大便制成的糞菌懸液,給予正常飲食飲水,在無(wú)特殊致病原SPF級(jí)別條件飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)0周、1周、2周、4周時(shí)記錄兩組小鼠體重變化,應(yīng)用胭脂紅紅色溶劑灌胃后記錄全胃腸道通過(guò)時(shí)間。另取10周齡ICR無(wú)菌小鼠作為無(wú)菌小鼠糞菌移植四周后的年齡對(duì)照組。肉眼記錄小腸長(zhǎng)度、結(jié)腸長(zhǎng)度。HE染色觀察胃、小腸、結(jié)腸大體形態(tài)變化。糞菌移植4周后檢測(cè)胃排空量及腸道免疫相關(guān)分子水平變化。結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)4周后糞菌移植組小鼠胃、小腸、結(jié)腸粘膜厚度均較6周齡及同周齡無(wú)菌小鼠有明顯增厚,與野生組小鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)糞菌移植組小鼠小腸及大腸的長(zhǎng)度較6周齡無(wú)菌小鼠及同周齡年齡無(wú)菌小鼠有增長(zhǎng)趨勢(shì),與野生組小鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)無(wú)菌小鼠全胃腸道通過(guò)時(shí)間長(zhǎng)于野生組小鼠;糞菌移植組全胃腸道通過(guò)時(shí)間短于6周齡及同周齡無(wú)菌小鼠。糞菌移植組小鼠全胃腸道通過(guò)時(shí)間較同周齡野生組小鼠無(wú)明顯差異。(4)無(wú)菌小鼠胃排空率低于野生型小鼠;糞菌移植組胃排空率高于同周齡無(wú)菌小鼠,較野生組小鼠無(wú)差異。(5)糞菌移植可促進(jìn)小鼠免疫系統(tǒng)成熟,增加CD4+T細(xì)胞比例,IL22因子及Reg蛋白表達(dá)水平升高。第二部分腸道菌群通過(guò)5-HT/巨噬細(xì)胞途徑調(diào)控胃腸動(dòng)力方法:我們收集上述對(duì)照組及糞菌移植組4周后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)5-HT陽(yáng)性腸上皮細(xì)胞含量變化,巨噬細(xì)胞表型變化,巨噬細(xì)胞活化情況。Realtime PCR檢測(cè)5-HT限速酶TPH m RNA水平變化,進(jìn)一步分析5-HT、巨噬細(xì)胞表型與胃腸道通過(guò)時(shí)間三者間的相關(guān)性及可能機(jī)制探討。結(jié)果:(1)糞菌移植組及無(wú)菌組小鼠胃、小腸、結(jié)腸粘膜上皮可見(jiàn)5-HT免疫陽(yáng)性細(xì)胞及M2型巨噬細(xì)胞;胃、小腸、結(jié)腸肌層神經(jīng)團(tuán)周?chē)梢?jiàn)M2型巨噬細(xì)胞。(2)糞菌移植可明顯增加胃腸道肌層M2型巨噬細(xì)胞,而M1型巨噬細(xì)胞無(wú)明顯變化。(3)糞菌移植可明顯增加胃腸道粘膜層5-HT免疫陽(yáng)性細(xì)胞。(4)糞菌移植可促進(jìn)無(wú)菌小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)。(5)全胃腸道通過(guò)時(shí)間與胃腸道粘膜層5-HT免疫陽(yáng)性細(xì)胞及胃腸道肌層M2型巨噬細(xì)胞呈負(fù)性相關(guān)。(6)在全胃腸道上皮組織粘膜層和肌層中5-HT免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與M2型巨噬細(xì)胞呈正性相關(guān)。第三部分腸道菌群可通過(guò)影響GLP-1/GLP-1r途徑調(diào)控胃腸動(dòng)力方法:我們將6周齡的ICR野生型小鼠和6周齡ICR無(wú)菌小鼠分為兩組:野生型組及糞菌移植組。實(shí)驗(yàn)0周、4周時(shí)兩組分別尾靜脈注射GLP-1類(lèi)似物Exendin4,胭脂紅紅色溶劑灌胃后記錄全胃腸道通過(guò)時(shí)間。收集糞菌移植4周后兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GLP-1及GLP-1受體陽(yáng)性細(xì)胞含量變化,腸道神經(jīng)細(xì)胞水平變化。Realtime PCR檢測(cè)糞菌移植對(duì)動(dòng)物胃腸道組織及細(xì)菌上清液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞GLP-1r m RNA水平的影響,進(jìn)一步分析GLP-1、GLP-1受體、腸道神經(jīng)細(xì)胞與胃腸道通過(guò)時(shí)間幾者間的相關(guān)性及可能機(jī)制探討。結(jié)果:(1)糞菌移植組及無(wú)菌組小鼠小腸、結(jié)腸粘膜內(nèi)分泌細(xì)胞可見(jiàn)GLP-1表達(dá);胃、小腸、結(jié)腸組織肌間神經(jīng)細(xì)胞中可見(jiàn)GLP-1受體表達(dá)。(2)糞菌移植組胃腸道GLP-1的表達(dá)上升,與機(jī)體發(fā)育相關(guān)。(3)糞菌移植可明顯減少胃腸道肌間神經(jīng)細(xì)胞GLP-1受體陽(yáng)性細(xì)胞。(4)無(wú)菌組小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)明顯低于糞菌移植組。糞菌移植可促進(jìn)無(wú)菌小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)。(5)全胃腸道通過(guò)時(shí)間與胃腸道GLP-1受體陽(yáng)性細(xì)胞呈正性相關(guān)。(6)給予上述兩組小鼠GLP-1受體激動(dòng)劑后,無(wú)菌小鼠全胃腸道通過(guò)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。結(jié)論:糞菌移植可促進(jìn)無(wú)菌小鼠胃腸運(yùn)動(dòng),通過(guò)與胃腸組織中的免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用而發(fā)揮關(guān)鍵作用。糞菌移植可(1)上調(diào)5-HT表達(dá),使巨噬細(xì)胞向M2型極化,進(jìn)而啟動(dòng)巨噬細(xì)胞-神經(jīng)細(xì)胞通路,(2)改變腸道肌間神經(jīng)細(xì)胞GLP-1/GLP-1受體表達(dá)水平,促進(jìn)胃腸動(dòng)力。
【圖文】：

圖 1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖（FMT：糞菌移植；GF：無(wú)菌小鼠；SPF：無(wú)特殊致病菌；GI transittime：胃腸道通過(guò)時(shí)間；Tissue：留取組織標(biāo)本；Gastric emptying：胃排空率；w：周）1.2.2.2 制備糞菌移植菌液（1）選取健康適齡野生型 ICR 小鼠作為供體；（2）收取新鮮排出的小鼠糞便，電子天平立即對(duì)新鮮糞便進(jìn)行稱(chēng)重；（3）按照參考文獻(xiàn)所示，使用生理鹽水將糞便 10 倍稀釋于其中，細(xì)致研磨后過(guò)濾糞便殘?jiān)�；�?）將所得新鮮糞菌液混合，冰上轉(zhuǎn)運(yùn)，用于 FMT。1.2.2.3 糞菌移植方法將每只小鼠分別轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的籠中，用灌胃針吸取過(guò)濾后新鮮菌液，以灌胃的方式打入小鼠胃內(nèi)，每只小鼠灌入 0.3mL 新鮮菌液，灌胃后觀察 30 分鐘，，實(shí)驗(yàn)小鼠未出現(xiàn)任何異常后合籠飼養(yǎng)。1.2.2.4 標(biāo)本留取方法（1）FMT 組小鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理后收集數(shù)據(jù)不同分為胃腸道通過(guò)時(shí)間和組織

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、糞菌移植促進(jìn)無(wú)菌小鼠胃腸動(dòng)力在一共 28 天的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各組小鼠耐受情況均可，除糞菌移植組 ICR 小鼠在糞菌移植時(shí)出現(xiàn)短暫?jiǎn)芸�、呼吸受阻外，其余未均未出現(xiàn)便血、腹瀉、便秘及死亡現(xiàn)象。各組小鼠體重隨著時(shí)間逐漸增長(zhǎng)，糞菌移植組與野生組 ICR 小鼠體重增長(zhǎng)相比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)圖 1.2）
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R57

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本文編號(hào)：2540720