【摘要】：目的:腸道微生物種類繁多,數(shù)目龐大,其中細菌總量可占微生物總數(shù)的99%以上。這些在腸道內(nèi)定植、復雜多樣的細菌就被稱之為腸道菌群。腸道菌群目前被認為是人類后天獲得的一種重要器官。腸道菌群在宿主生理學中可起多重關(guān)鍵作用,包括輔助宿主消化吸收、調(diào)節(jié)能量吸收與代謝、參與機體免疫系統(tǒng)活化等。已知腸道菌群可促進宿主胃腸道運動,可能通過與胃腸組織中的免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用而發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其作用途徑與機制尚不明確。5-羥色胺(5-HT)不僅作為神經(jīng)遞質(zhì)而且在胃腸組織中作為免疫系統(tǒng)的介質(zhì),在調(diào)節(jié)胃腸道免疫系統(tǒng)和胃腸運動中可能起著關(guān)鍵作用。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是由腸內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生的腸降血糖素激素,其生理學功能必須通過相應(yīng)GLP-1受體的介導才能產(chǎn)生作用,不僅調(diào)節(jié)葡萄糖體內(nèi)平衡,而且調(diào)節(jié)胃腸蠕動。因此本研究擬以無菌小鼠為研究對象,探討腸道菌群如何影響胃腸蠕動,運用糞菌移植建立腸道運動改變的小鼠模型從5-HT表達和巨噬細胞行為之間的關(guān)聯(lián)及GLP-1/GLP-1受體表達水平探索腸道菌群影響胃腸運動的機制。第一部分糞菌移植對無菌小鼠胃腸運動的影響方法:我們將6周齡的ICR野生型小鼠和6周齡ICR無菌小鼠分為兩組:野生型組給予正常飲食飲水;糞菌移植組于無菌小鼠到達當時即刻以灌胃的方式給予SPF級別ICR野生型小鼠新鮮大便制成的糞菌懸液,給予正常飲食飲水,在無特殊致病原SPF級別條件飼養(yǎng)。實驗0周、1周、2周、4周時記錄兩組小鼠體重變化,應(yīng)用胭脂紅紅色溶劑灌胃后記錄全胃腸道通過時間。另取10周齡ICR無菌小鼠作為無菌小鼠糞菌移植四周后的年齡對照組。肉眼記錄小腸長度、結(jié)腸長度。HE染色觀察胃、小腸、結(jié)腸大體形態(tài)變化。糞菌移植4周后檢測胃排空量及腸道免疫相關(guān)分子水平變化。結(jié)果:(1)實驗4周后糞菌移植組小鼠胃、小腸、結(jié)腸粘膜厚度均較6周齡及同周齡無菌小鼠有明顯增厚,與野生組小鼠無統(tǒng)計學差異。(2)糞菌移植組小鼠小腸及大腸的長度較6周齡無菌小鼠及同周齡年齡無菌小鼠有增長趨勢,與野生組小鼠無統(tǒng)計學差異。(3)無菌小鼠全胃腸道通過時間長于野生組小鼠;糞菌移植組全胃腸道通過時間短于6周齡及同周齡無菌小鼠。糞菌移植組小鼠全胃腸道通過時間較同周齡野生組小鼠無明顯差異。(4)無菌小鼠胃排空率低于野生型小鼠;糞菌移植組胃排空率高于同周齡無菌小鼠,較野生組小鼠無差異。(5)糞菌移植可促進小鼠免疫系統(tǒng)成熟,增加CD4+T細胞比例,IL22因子及Reg蛋白表達水平升高。第二部分腸道菌群通過5-HT/巨噬細胞途徑調(diào)控胃腸動力方法:我們收集上述對照組及糞菌移植組4周后實驗動物組織。免疫組織化學染色檢測5-HT陽性腸上皮細胞含量變化,巨噬細胞表型變化,巨噬細胞活化情況。Realtime PCR檢測5-HT限速酶TPH m RNA水平變化,進一步分析5-HT、巨噬細胞表型與胃腸道通過時間三者間的相關(guān)性及可能機制探討。結(jié)果:(1)糞菌移植組及無菌組小鼠胃、小腸、結(jié)腸粘膜上皮可見5-HT免疫陽性細胞及M2型巨噬細胞;胃、小腸、結(jié)腸肌層神經(jīng)團周圍可見M2型巨噬細胞。(2)糞菌移植可明顯增加胃腸道肌層M2型巨噬細胞,而M1型巨噬細胞無明顯變化。(3)糞菌移植可明顯增加胃腸道粘膜層5-HT免疫陽性細胞。(4)糞菌移植可促進無菌小鼠胃腸運動。(5)全胃腸道通過時間與胃腸道粘膜層5-HT免疫陽性細胞及胃腸道肌層M2型巨噬細胞呈負性相關(guān)。(6)在全胃腸道上皮組織粘膜層和肌層中5-HT免疫陽性細胞數(shù)量與M2型巨噬細胞呈正性相關(guān)。第三部分腸道菌群可通過影響GLP-1/GLP-1r途徑調(diào)控胃腸動力方法:我們將6周齡的ICR野生型小鼠和6周齡ICR無菌小鼠分為兩組:野生型組及糞菌移植組。實驗0周、4周時兩組分別尾靜脈注射GLP-1類似物Exendin4,胭脂紅紅色溶劑灌胃后記錄全胃腸道通過時間。收集糞菌移植4周后兩組實驗動物組織。免疫組織化學染色檢測GLP-1及GLP-1受體陽性細胞含量變化,腸道神經(jīng)細胞水平變化。Realtime PCR檢測糞菌移植對動物胃腸道組織及細菌上清液對神經(jīng)細胞GLP-1r m RNA水平的影響,進一步分析GLP-1、GLP-1受體、腸道神經(jīng)細胞與胃腸道通過時間幾者間的相關(guān)性及可能機制探討。結(jié)果:(1)糞菌移植組及無菌組小鼠小腸、結(jié)腸粘膜內(nèi)分泌細胞可見GLP-1表達;胃、小腸、結(jié)腸組織肌間神經(jīng)細胞中可見GLP-1受體表達。(2)糞菌移植組胃腸道GLP-1的表達上升,與機體發(fā)育相關(guān)。(3)糞菌移植可明顯減少胃腸道肌間神經(jīng)細胞GLP-1受體陽性細胞。(4)無菌組小鼠胃腸運動明顯低于糞菌移植組。糞菌移植可促進無菌小鼠胃腸運動。(5)全胃腸道通過時間與胃腸道GLP-1受體陽性細胞呈正性相關(guān)。(6)給予上述兩組小鼠GLP-1受體激動劑后,無菌小鼠全胃腸道通過時間明顯延長。結(jié)論:糞菌移植可促進無菌小鼠胃腸運動,通過與胃腸組織中的免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用而發(fā)揮關(guān)鍵作用。糞菌移植可(1)上調(diào)5-HT表達,使巨噬細胞向M2型極化,進而啟動巨噬細胞-神經(jīng)細胞通路,(2)改變腸道肌間神經(jīng)細胞GLP-1/GLP-1受體表達水平,促進胃腸動力。
【圖文】：

圖 1.1 實驗設(shè)計示意圖（FMT：糞菌移植；GF：無菌小鼠；SPF：無特殊致病菌；GI transittime：胃腸道通過時間；Tissue：留取組織標本；Gastric emptying：胃排空率；w：周）1.2.2.2 制備糞菌移植菌液（1）選取健康適齡野生型 ICR 小鼠作為供體；（2）收取新鮮排出的小鼠糞便，電子天平立即對新鮮糞便進行稱重；（3）按照參考文獻所示，使用生理鹽水將糞便 10 倍稀釋于其中，細致研磨后過濾糞便殘渣；（4）將所得新鮮糞菌液混合，冰上轉(zhuǎn)運，用于 FMT。1.2.2.3 糞菌移植方法將每只小鼠分別轉(zhuǎn)移到單獨的籠中，用灌胃針吸取過濾后新鮮菌液，以灌胃的方式打入小鼠胃內(nèi)，每只小鼠灌入 0.3mL 新鮮菌液，灌胃后觀察 30 分鐘，，實驗小鼠未出現(xiàn)任何異常后合籠飼養(yǎng)。1.2.2.4 標本留取方法（1）FMT 組小鼠根據(jù)實驗處理后收集數(shù)據(jù)不同分為胃腸道通過時間和組織

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、糞菌移植促進無菌小鼠胃腸動力在一共 28 天的實驗周期內(nèi)，各組小鼠耐受情況均可，除糞菌移植組 ICR 小鼠在糞菌移植時出現(xiàn)短暫嗆咳、呼吸受阻外，其余未均未出現(xiàn)便血、腹瀉、便秘及死亡現(xiàn)象。各組小鼠體重隨著時間逐漸增長，糞菌移植組與野生組 ICR 小鼠體重增長相比較均無統(tǒng)計學差異（見圖 1.2）
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R57

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本文編號：2540720