【摘要】：目的：p53正向細(xì)胞凋亡調(diào)控因子(p53upregulated modulator of apoptos is, PUMA)是Bcl-2家族唯BH3結(jié)構(gòu)域亞家族成員,位于線粒體內(nèi),正常情況下表達(dá)很低,可被多種損傷因素如射線、病毒、化療藥物等誘導(dǎo)激活。PUMA通過其特有的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2或Bcl-xL等抗凋亡蛋白結(jié)合后抑制其抗凋亡作用。PUMA抑制劑模擬BH3結(jié)構(gòu)域與抗凋亡蛋白結(jié)合,阻礙PUMA與Bcl-2樣蛋白結(jié)合,凋亡被抑制。我們想觀察PUMA在兩種不同的模型下表達(dá)情況以及PUMA抑制劑能否對(duì)細(xì)胞或組織起到保護(hù)作用。 方法：(1)選取懷孕13.5天的ICR小鼠,提取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast, MEFs)(2)用不同濃度阿霉素(Doxorubicin, DOX)刺激MEFs觀察PUMA表達(dá)及細(xì)胞損傷情況,并用PUMA抑制劑觀察對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。(3)用C57BL/6小鼠建立缺血-再灌注模型,分為假手術(shù)組、手術(shù)組和PUMA抑制劑組。(4)采取不同缺血和再灌注時(shí)間觀察血清ALT水平,做Western Blot檢測(cè)PUMA蛋白水平表達(dá),做反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PUMA mRNA水平表達(dá),做肝臟HE切片看損傷情況,TUNEL染色看肝臟細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：當(dāng)阿霉素濃度在0.5-5mg/L時(shí),可以刺激MEFs PUMA表達(dá)升高,加藥濃度再升高PUMA表達(dá)反而降低；用1μMPUMA抑制劑可以抑制阿霉素低濃度刺激的PUMA表達(dá),且能保護(hù)MEFs抵抗阿霉素導(dǎo)致的損傷。對(duì)于小鼠缺血-再灌注損傷模型,根據(jù)缺血、再灌注時(shí)間不同,損傷情況各異。當(dāng)缺血時(shí)間為60分鐘,再灌注1小時(shí),肝臟損傷較輕,PUMA表達(dá)升高,PUMA抑制劑可保護(hù)肝臟抵抗損傷；當(dāng)缺血時(shí)間長至90分鐘,再灌注一小時(shí),肝臟損傷較嚴(yán)重時(shí),PUMA表達(dá)升高不明顯,PUMA抑制劑無法起到保護(hù)作用。 結(jié)論：PUMA在一定損傷范圍內(nèi)可被誘導(dǎo)激活,此時(shí)凋亡是主要損傷途徑,應(yīng)用PUMA抑制劑可以降低PUMA蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),細(xì)胞凋亡被抑制,保護(hù)細(xì)胞或組織抵抗損傷。當(dāng)刺激因素過強(qiáng),凋亡不是損傷的主要表現(xiàn)途徑,PUMA表達(dá)升高不明顯。PUMA抑制劑在體內(nèi)體外均可發(fā)揮作用,說明其應(yīng)用可能會(huì)很廣泛。我們今后將會(huì)用PUMA KO小鼠驗(yàn)證我們的結(jié)果并建立肝臟冷缺血-再灌注模型或器官移植模型觀察PUMA缺失或被抑制后能否對(duì)器官產(chǎn)生保護(hù)作。
[Abstract]:Objective: p53 positive apoptosis regulator (p53upregulated modulator of apoptos is, PUMA) is a member of the BH3 domain subfamily of Bcl-2 family, which is located in the plasmid. The expression of p53 is very low under normal conditions, and can be damaged by a variety of damage factors such as rays and viruses. Puma can inhibit the anti-apoptosis effect of Bcl-2 or Bcl-xL through its unique Bcl-2 or Bcl-xL domain. Puma inhibitor mimics the binding of BH3 domain to anti-apoptotic protein. Apoptosis was inhibited by blocking the binding of PUMA to Bcl-2-like proteins. We want to observe the expression of PUMA in two different models and whether PUMA inhibitors can protect cells or tissues. Methods: (1) the mouse embryonic fibroblasts (mouse embryo fibroblast, MEFs) (2 were extracted from ICR mice on the 13th day of pregnancy. MEFs expression and cell injury were observed by different concentrations of doxorubicin (Doxorubicin, DOX) (doxorubicin (Doxorubicin, DOX). The protective effect of PUMA inhibitor on cells was observed. (3) the model of ischemia-reperfusion in C57BL/6 mice was established and divided into three groups: sham operation group, operation group and PUMA inhibitor group. (4) the level of serum ALT was observed at different time of ischemia and reperfusion. The expression of PUMA protein was detected by Western Blot, the expression of PUMA mRNA was detected by reverse transcription-real-time quantitative PCR, the injury was observed by HE section of liver, and the apoptosis of liver cells was observed by TUNEL staining. Results: when the concentration of doxorubicin was in 0.5-5mg/L, the expression of MEFs PUMA was increased, and the expression of PUMA was decreased when the concentration of doxorubicin was increased and then increased. 1 渭 MPUMA inhibitor could inhibit the expression of PUMA stimulated by low concentration of doxorubicin and protect MEFs from doxorubicin induced damage. For the model of ischemia-reperfusion injury in mice, the injury was different according to the time of ischemia and reperfusion. When the ischemia time was 60 minutes and the reperfusion time was 1 hour, the liver injury was mild and the expression of PUMA was increased. PUMA inhibitor could protect the liver from injury. When the ischemia time was as long as 90 minutes and the liver injury was serious for one hour, the expression of PUMA did not increase significantly, and PUMA inhibitor could not play a protective role. Conclusion: PUMA can be induced and activated in a certain range of injury. Apoptosis is the main pathway of injury. PUMA inhibitor can reduce the expression of PUMA protein and transcription, inhibit apoptosis and protect cells or tissues from injury. When the stimulator is too strong, apoptosis is not the main way of injury, and the expression of PUMA is not significantly increased. PUMA inhibitors can play a role in vivo and in vitro, indicating that PUMA inhibitor may be widely used. In the future, we will use PUMA KO mice to verify our results and establish a cold ischemia-reperfusion model or organ transplantation model to observe whether PUMA deletion or inhibition can protect the organs.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2482632