發(fā)布時間：2019-04-20 11:43

【摘要】：背景： 慢性肝病時，通常處于靜息狀態(tài)的肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)被激活，表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)，表達α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA)，收縮性增強，促進了肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。HSCs的收縮功能在調(diào)節(jié)肝竇血流量和肝內(nèi)血管阻力方面起著重要作用，與肝硬化門脈高壓的發(fā)生有密切的關(guān)系。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是最顯著引起HSCs收縮的物質(zhì)。肝竇收縮和肝內(nèi)血流阻力升高主要與ET-1引起HSCs的收縮有關(guān)。因此，針對活化的HSCs的收縮功能進行調(diào)節(jié)將有可能會成為肝硬化門脈高壓治療的新途徑。脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種脂肪細胞因子，近年來研究發(fā)現(xiàn)它具有預(yù)防肝纖維化的作用。我們前期實驗結(jié)果顯示，脂聯(lián)素能夠通過激活A(yù)MPK途徑明顯上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)的蛋白表達、增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成而對HSC-T6細胞的增殖、遷移具有抑制作用。然而，脂聯(lián)素是否可以影響HSCs的收縮，其機制是否與調(diào)節(jié)ET-1表達及相互作用相關(guān)，這些研究對進一步揭示其在門脈高壓的肝內(nèi)血管阻力的變化機制具有重要的臨床意義，此方面的研究國內(nèi)外尚未見報道。 目的： 本實驗以活化的大鼠HSCs(HSC-T6細胞系)為研究對象，觀察脂聯(lián)素與ET-1共同作用下的HSCs收縮的情況，檢測外源性脂聯(lián)素對HSCs的ET-1的基因及生物學(xué)特性有何影響，探討脂聯(lián)素對ET-1誘導(dǎo)的HSCs收縮的影響及可能的作用機制，為脂聯(lián)素降低肝硬化門脈高壓提供新的理論依據(jù)。 方法： 1.脂聯(lián)素、ET-1及脂聯(lián)素與ET-1共同作用下對HSC-T6收縮的影響：應(yīng)用膠原晶格法檢測HSC-T6的收縮，收集對數(shù)生長期的HSC-T6，將細胞混懸液接種于預(yù)先制備好的膠原凝膠上，將細胞同步化后分別加入相關(guān)藥物進行干預(yù)試驗，分為6組：A.空白對照組；B.脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組；C.ET-1(10nmol/L)組；D.脂聯(lián)素(0.25μg/mL)+ET-1(10nmol/L)組；E.脂聯(lián)素(0.5μg/mL)+ET-1(10nmol/L)組；F.脂聯(lián)素(0.5μg/mL)+ET-1(10nmol/L)+L-NAME (5mmol/L)組。通過觀察細胞膠原凝膠剝離后24h時的大小，，判斷各組的HSC-T6的收縮情況。 2.檢測脂聯(lián)素對活化的HSC-T6細胞系ET-1分子生物學(xué)的影響：(1)實時定量PCR(qRT-PCR)檢測各組HSC-T6中ET-1mRNA的表達；(2) Western blot檢測各組HSC-T6中ET-1蛋白的表達；(3)采用ELISA檢測各組培養(yǎng)上清液中ET-1蛋白的表達。實驗分組：A.空白對照組；B.脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組；C.脂聯(lián)素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)組。 3.探討脂聯(lián)素影響ET-1誘導(dǎo)的HSCs收縮的信號傳導(dǎo)機制：分別采用qRT-PCR及Western blot檢測不同濃度的脂聯(lián)素與ET-1共同作用下HSC-T6細胞中iNOS的mRNA及蛋白水平的表達。采用Western blot檢測不同濃度的脂聯(lián)素與ET-1共同作用下HSC-T6細胞中AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt蛋白水平的表達。實驗分組：A：空白對照組；B：ET-1(10nmol/L)組；C：Adiponectin (0.5μg/mL)+ET-1(10nmol/L)組；D：Adiponectin (1μg/mL)+ET-1(10nmol/L)組；E：Adiponectin(2μg/mL)+ET-1(10nmol/L)組。 結(jié)果： 1.通過膠原晶格實驗顯示：ET-1(10nmol/L)可導(dǎo)致HSC-T6明顯收縮，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；脂聯(lián)素可以抑制ET-1誘導(dǎo)的HSC-T6收縮，并呈濃度依賴性，0.5μg/mL脂聯(lián)素能明顯抑制ET-1(10nmol/L)引起的HSC-T6收縮，與ET-1組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；L-NAME (5mmol/L)可以部分抵消脂聯(lián)素(0.5μg/mL)對ET-1(10nmol/L)引起HSC-T6收縮的抑制作用，與ET-1組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.通過qRT-PCR定量檢測HSC-T6細胞中ET-1mRNA的表達水平：與空白對照組相比，脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組ET-1的mRNA表達水平顯著下降(P0.05)，而脂聯(lián)素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)組中出現(xiàn)ET-1mRNA表達的下降，但與空白對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；通過Western blot法檢測HSC-T6細胞中ET-1蛋白的表達：與空白對照組相比，脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組ET-1的蛋白表達明顯下降(P0.05)，脂聯(lián)素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)組ET-1的蛋白表達略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中ET-1蛋白的表達：與空白對照組相比，脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組ET-1的蛋白表達明顯下降(P0.05)，脂聯(lián)素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)組ET-1的蛋白表達有所下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 3.通過qRT-PCR法檢測iNOS mRNA的表達量：HSC-T6細胞中有iNOSmRNA表達，加入ET-1(10nmol/L)后iNOS mRNA表達量明顯下降(P0.01)，同時加入ET-1(10nmol/L)和脂聯(lián)素(0.5μg/mL)作用后iNOS mRNA表達較ET-1組增加，且隨著脂聯(lián)素濃度升高iNOS mRNA表達量有逐漸升高的趨勢；Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)HSC-T6細胞中iNOS蛋白表達與mRNA表達趨勢一致。通過Western blot法檢測AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt的蛋白表達水平，結(jié)果顯示：對照組中p-AMPK有輕微表達， ET-1(10nmol/L)組p-AMPK幾乎無表達，ET-1(10nmol/L)+脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組p-AMPK有表達，且隨著脂聯(lián)素濃度升高p-AMPK表達逐漸增強，而各實驗組之間總AMPK表達無明顯差異。各實驗組之間總Akt表達無明顯差異，ET-1(10nmol/L)組p-Akt的表達量明顯升高，而ET-1(10nmol/L)+脂聯(lián)素(0.5μg/mL)組p-Akt的表達下降，且隨著脂聯(lián)素濃度升高p-Akt的表達量有逐漸減低的趨勢。 結(jié)論： 1、脂聯(lián)素能夠抑制ET-1誘導(dǎo)的HSCs收縮。 2、脂聯(lián)素在mRNA及蛋白水平抑制了活化的HSCs中ET-1的合成，并且抑制HSCs自分泌ET-1。 3、脂聯(lián)素抑制ET-1誘導(dǎo)HSCs的收縮可能是通過激活A(yù)MPK，從而提高HSCs細胞內(nèi)的NO水平以及阻斷Akt信號通路實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 查棠春;王德英;;1例酒精性肝硬化伴戒酒綜合征的護理[J];安徽醫(yī)藥;2009年12期

2 周輝;楊樹清;劉君俊;沈金勇;;腹水超濾濃縮回輸聯(lián)合靜脈輸入人血白蛋白、利尿治療頑固性腹水療效觀察[J];北方藥學(xué);2011年05期

3 谷峰;陳賓;向榮;田亞平;;肝臟疾病患者血清酶活性與凝血四項的變化規(guī)律及輔助診斷價值研究[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2011年04期

4 宋春霞;張伯鵬;李炎;閻志欣;;恩替卡韋治療乙型肝炎肝硬化伴肝源性糖尿病臨床療效觀察[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年13期

5 譚妹蓮;陳波林;;16例吸毒致丙型肝炎患者的臨床護理[J];當(dāng)代護士(學(xué)術(shù)版);2005年12期

6 羅鳳琳;;肝硬化合并上消化道出血臨床分析[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2011年02期

7 張建成;沈艷平;;48例肝硬化并上消化道出血臨床診治分析探討[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2011年06期

8 郭怡萍;;重癥監(jiān)護對上消化出血治療結(jié)果的影響研究[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2012年11期

9 張玉臣,高得勇,孫潔;病毒性肝炎臨床分型與病理診斷分析[J];實用肝臟病雜志;2005年05期

10 馮靜;孫艷梅;許傳娟;;乙型肝炎肝硬化合并肝源性糖尿病的治療[J];實用肝臟病雜志;2007年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張珍;;重癥肝炎血漿置換術(shù)的護理進展[A];第二屆全國人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會論文集[C];2005年

2 張治國;楊杰;張智;向麗華;;舌象與肝病關(guān)系臨床研究集析[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會診斷專業(yè)委員會2009’年會論文集[C];2009年

3 劉春文;周觀林;王利勤;黃云秀;曾敬科;梁斌;羅穎敏;楊沛華;蔡志誠;陳怡文;;復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合熊去氧膽酸片治療殘留黃疸療效觀察[A];江西省第三次中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議暨江西省中西醫(yī)結(jié)合肝病新進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 賈愛芹;清肝抑纖飲及其拆方防治大鼠肝纖維化的實驗研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

2 黎寧欽;小型豬肝纖維化模型制備及MSCTP研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2007年

3 廖錦元;MSCT評價小型豬終末期肝病肝功能儲備實驗研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

4 羅亞萍;手機頻率電磁輻射對大鼠肝臟的影響及西洋參膠囊對其干預(yù)作用的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號：2461578