【摘要】：目的 自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一種病因不明的肝臟慢性炎癥性疾病。目前,AIH的治療主要是應(yīng)用免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素,它可單獨應(yīng)用也可與硫唑嘌呤聯(lián)合應(yīng)用,但這種治療方案的完全緩解率并不高,且長期服藥存在較多副作用,因此迫切需要尋找和探討新的有效治療方法.骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是來源于骨髓中的一種多能干細胞,具有多方向分化的潛能及強大的免疫調(diào)節(jié)作用,大量動物實驗和臨床研究證實BMMSCs對多種自身免疫性疾病都有很好的治療作用。本實驗以刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)誘導(dǎo)小鼠建立AIH模型,通過尾靜脈途徑移植氯甲基苯甲酰胺(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Di1)標(biāo)記的BMMSCs,觀察其在AIH中的治療效果,以及移植后細胞在肝組織內(nèi)存活、分布情況,并對其可能的治療機制進行探討,為臨床BMMSCs的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。 材料和方法 1.小鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外標(biāo)記采用全骨髓貼壁法體外分離C57BL/6、鼠的BMMSCs,并進行傳代培養(yǎng)。采取第三代BMMSCs,應(yīng)用流式細胞儀檢測其細胞表型,并采用茜素紅染色鑒定其骨向分化能力,以油紅0染色鑒定其脂向分化能力。體外應(yīng)用CM-Dil熒光染料標(biāo)記第三代BMMSCs,熒光顯微鏡下觀察細胞標(biāo)記率。 2.AIH模型小鼠的建立將C57BL/6小鼠隨機分為4組,分別為實驗A、B、和C組及正常對照組。A組、B組和C組分別由尾靜脈注射ConA10mg/kg-1、15mg/kg-1和20mg/kg,而正常對照組由尾靜脈注射等體積的磷酸鹽緩沖液。于注射后8h取血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平；取肝臟制作病理切片,根據(jù)Knodell肝炎活動指數(shù)評分系統(tǒng)對肝組織的炎癥程度作出評分；取實驗組小鼠心、脾、肺等組織觀察有無炎癥反應(yīng)。 3. BMMSCs肝組織中的分布情況及對AIH的治療效果由尾靜脈注射移植CM-Dil標(biāo)記的BMMSCs,依據(jù)不同細胞量,將C57BL/6小鼠AIH模型組分為4組,尾靜脈輸注ConA,30min后移植CM-Dil標(biāo)記的BMMSCs。模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組和模型Ⅳ組移植的細胞量分別為1×105,5×105,1×106,1×107；而空白對照組尾靜脈輸注ConA,30min后注入等體積的磷酸鹽緩沖液。24h后處死小鼠,取血清標(biāo)本檢測ALT、AST及腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干擾素γ (Interferon-γ, IFN-γ)及白細胞介素(Interleukin-4, IL-4)的水平；取肝組織行病理檢查其炎癥程度并作出Knodell評分；取模型組心、肝、脾、肺組織在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。 結(jié)果 1.小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)在接種48h后可見貼壁細胞,培養(yǎng)到第三代細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一,細胞排列呈束狀、漩渦狀或放射狀。流式細胞儀檢測BMMSCs的表面特異性抗原,結(jié)果顯示CD29、CD90呈陽性表達,CD34呈陰性表達；經(jīng)誘導(dǎo)后茜素紅染色、油紅0染色均呈陽性,符合BMMSCs的特征。體外應(yīng)用CM-Dil熒光染料標(biāo)記第三代BMMSCs,24h后熒光顯微鏡下觀察可見CM-Dil標(biāo)記在細胞膜上發(fā)紅色熒光,且標(biāo)記率達90%以上。 2.給以不同劑量的ConA后,A組、B組和C組血清ALT、AST的水平及Knodell評分均明顯高于對照組(P0.05),且隨著ConA注射劑量的增加,上述各項檢測指標(biāo)均有增高(P0.05)。實驗組小鼠除肝組織病理可見肝損害,呈炎癥改變以外,心、肺、脾未見損傷。 3.BMMSCs移植治療后,模型Ⅳ組小鼠有4只死亡,其余各組小鼠未見死亡。24h后模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清ALT、AST的水平及Knodell評分均明顯低于空白對照組(P0.05)；模型Ⅰ組與空白對照組之間比較上述指標(biāo)無顯著性差異(P0.05)。模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的水平明顯低于空白對照組(P0.05)；模型Ⅰ組與空白對照組之間比較上述指標(biāo)無顯著性差異(P0.05)。熒光顯微鏡下在受損的肝組織內(nèi)可觀察到植入的BMMSCs,而在心、脾、肺等重要臟器并未觀察到標(biāo)記的BMMSCs。 結(jié)論 1.小鼠的BMMSCs可采用全骨髓貼壁法在體外分離、培養(yǎng)、傳代、擴增。新型熒光染料CM-Dil體外標(biāo)記BMMSCs,方法簡單,標(biāo)記率高,可用于BMMSCs的體內(nèi)示蹤。 2.ConA誘導(dǎo)制作AIH小鼠模型簡單易行,且組織損傷具有肝臟特異性,可以用于AIH的實驗研究。 3. BMMSCs對ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠模型有良好的治療作用。BMMSCs可以遷移到受損的肝組織,并通過減少TNF-α、IFN-γ及IL-4等炎癥因子的分泌而避免肝細胞的炎癥反應(yīng),減輕肝臟損傷。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.1

【參考文獻】

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本文編號：2447994