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  本文關(guān)鍵詞：過氧化物酶體增殖物激活受體α對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學(xué)》 2014年

過氧化物酶體增殖物激活受體α對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制

焦明靜  

【摘要】：目的：急性肝衰竭是一種由炎癥介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷過程，預(yù)后極差，其器官損傷的免疫學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，尋求新的治療方法一直是該病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisomeproliferator-activated receptor α， PPAR α）是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，已被證實(shí)參與了細(xì)胞脂質(zhì)代謝、凋亡及炎癥反應(yīng)等。盡管多項(xiàng)研究表明PPAR α具有明確的抗炎作用，但在炎癥作為其主要病生理機(jī)制的急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中，PPAR α的作用及機(jī)制如何目前國內(nèi)外尚無研究報(bào)道。本研究的目的在于探討PPAR α對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制。 方法：本實(shí)驗(yàn)共分如下兩部分。 1動物實(shí)驗(yàn) 通過D-氨基半乳糖（D-Galactosamine， D-GalN）聯(lián)合脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）腹腔注射構(gòu)建小鼠急性肝衰竭模型，檢測PPAR α在疾病進(jìn)展過程中的動態(tài)表達(dá)變化及組織分布情況；給予PPAR α的選擇性激動劑Wy-14,643干預(yù)，觀察PPAR α對小鼠急性肝衰竭是否具有保護(hù)作用；分別用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）及自噬相關(guān)基因7的小干擾RNA(small interfering RNA against autophagyrelated gene7， siAtg7）抑制細(xì)胞自噬，觀察自噬受抑后能否逆轉(zhuǎn)PPAR α對小鼠急性肝衰竭的原有保護(hù)作用,以深入探討PPAR α對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭的作用機(jī)制。組織病理學(xué)分析及血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性測定觀察肝組織損傷的嚴(yán)重程度；實(shí)時(shí)定量PCR（Real Time-PCR)檢測PPAR α、促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、趨化因子（CXCL-1、CXCL-10）、自噬相關(guān)基因（ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的mRNA表達(dá)；蛋白印跡法（Western Blot）檢測PPARα、炎癥信號通路相關(guān)蛋白（p-NF-κBp65、p-JNK、p-ERK、p-P38）、自噬相關(guān)蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的蛋白表達(dá)。 2原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 通過LPS刺激小鼠骨髓來源的原代巨噬細(xì)胞(Bone marrow derivedmacrophage, BMM)制作原代細(xì)胞炎癥模型，給予Wy-14,643干預(yù)，從細(xì)胞學(xué)水平觀察PPAR α活化能否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制炎癥反應(yīng)；分別用3-MA、siAtg7抑制細(xì)胞自噬，觀察自噬受抑后能否逆轉(zhuǎn)PPAR α的原有抗炎作用，以進(jìn)一步探討PPAR α對急性肝衰竭發(fā)揮保護(hù)作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。向原代巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒并于熒光顯微鏡下觀察以檢測自噬小體的形成情況；Real Time-PCR檢測促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、趨化因子（CXCL-1、CXCL-10）的mRNA表達(dá)；Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的表達(dá)。 結(jié)果： 1PPAR α在急性肝衰竭時(shí)表達(dá)受抑，肝組織PPAR α的mRNA和蛋白表達(dá)水平在急性肝衰竭疾病進(jìn)展過程中逐漸降低。 2PPAR α活化促進(jìn)了細(xì)胞自噬，抑制了急性肝衰竭時(shí)的炎癥反應(yīng)，對急性肝衰竭產(chǎn)生保護(hù)作用。與急性肝衰竭模型組相比，PPAR α的選擇性激動劑Wy-14,643干預(yù)組小鼠肝大體形態(tài)接近于正常的肝臟，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，部分肝細(xì)胞呈氣球樣變，小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤不明顯，血清ALT、AST水平降低，促炎性細(xì)胞因子、趨化因子的mRNA及磷酸化的NF-κBp65、ERK、JNK蛋白表達(dá)減少；自噬相關(guān)基因ATG-5、ATG-7、LAMP-1和蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1表達(dá)增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3抑制自噬后加重了急性肝衰竭時(shí)的肝臟損傷和炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)了PPAR α對急性肝衰竭的原有保護(hù)作用。分別用3-MA、siAtg7抑制自噬后，小鼠肝呈黝黑色，肝細(xì)胞大片狀壞死，肝索解離，肝小葉結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)，匯管區(qū)及壞死區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，血清ALT、AST水平升高，促炎性細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4在原代巨噬細(xì)胞炎癥模型中，PPAR α活化抑制了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而且PPAR α的抗炎作用具有劑量依賴性。Real Time-PCR結(jié)果顯示分別用10μM、25μM、50μM的Wy-14,643干預(yù)LPS誘導(dǎo)的原代巨噬細(xì)胞炎癥模型，觀察到促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趨化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表達(dá)逐漸減少，表明PPAR α活化可抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且PPAR α的抗炎作用具有劑量依賴性。 5在原代巨噬細(xì)胞炎癥模型中，PPAR α活化促進(jìn)了細(xì)胞自噬，而且PPAR α對自噬的誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。我們分別用10μM、25μM、50μM的Wy-14,643干預(yù)已轉(zhuǎn)染入GFP-LC3質(zhì)粒的原代巨噬細(xì)胞并于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)隨著Wy-14,643干預(yù)濃度的增加，原代巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成逐漸增多；Western Blot結(jié)果顯示隨著Wy-14,643干預(yù)濃度的增加自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1的表達(dá)逐漸增多，說明PPAR α活化可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且PPAR α對自噬的誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。 6細(xì)胞自噬受抑后，逆轉(zhuǎn)了PPAR α的原有抗炎作用，，加劇了LPS誘導(dǎo)的原代巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Real Time-PCR結(jié)果顯示與單用Wy-14,643激活PPAR α相比，在加用3-MA、siAtg7抑制細(xì)胞自噬后，原代巨噬細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趨化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表達(dá)增加，說明細(xì)胞自噬受抑可使PPAR α的原有抗炎作用不復(fù)存在。 結(jié)論： 1PPAR α在急性肝衰竭的疾病進(jìn)展過程中表達(dá)受抑。 2PPAR α活化通過促進(jìn)細(xì)胞自噬減輕肝組織的炎癥反應(yīng)，對急性肝衰竭產(chǎn)生保護(hù)作用。 3抑制自噬可加重急性肝衰竭時(shí)的肝臟損傷及肝組織的炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)PPAR α對急性肝衰竭的原有保護(hù)作用。 4PPAR α可能成為臨床上防治急性肝衰竭的一個(gè)新的、重要的靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.3
【目錄】：

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8 焦明靜;過氧化物酶體增殖物激活受體α對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

9 劉志紅;非生物型人工肝對急性肝衰竭炎性介質(zhì)的清除作用與生存影響的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2005年

10 王凱;非生物型組合人工肝治療急性肝衰竭動物高顱壓的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：過氧化物酶體增殖物激活受體α對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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