【摘要】：臨床研究表明膽汁淤積性肝臟疾病往往伴隨有血漿內(nèi)源性阿片肽水平的升高。在膽道梗阻患者和動物模型的報道中，血漿內(nèi)源性甲硫氨酸腦啡肽的水平可升高至正常值的二到六倍。升高的內(nèi)源性阿片肽不僅會損害心血管、肝、腎功能，還可誘發(fā)劇烈的皮膚瘙癢等副反應。在本課題組以前的研究中，我們還發(fā)現(xiàn)，阻塞性黃疸患者術(shù)中地氟醚、異氟醚和瑞芬太尼等的需求量較非黃疸患者顯著降低，提示上調(diào)的內(nèi)源性阿片肽水平可能也介導了黃疸患者基礎(chǔ)痛閾值的升高。然而，關(guān)于阻塞性黃疸患者內(nèi)源性阿片類物質(zhì)合成增加的機制仍不明確。 最近對黃疸動物模型的研究表明，人體最大的器官--皮膚腦啡肽合成增加可能在膽汁淤積性疾病內(nèi)源性阿片肽升高的過程中起著至關(guān)重要的作用。正常人體皮膚的角質(zhì)形成細胞即可表達甲硫氨酸腦啡肽，且其表達可以通過化學或物理刺激上調(diào)。但至今還沒有臨床研究報告膽汁淤積患者皮膚腦啡肽的表達模式。先前的研究還表明，凝血酶，即在急性和慢性肝損傷過程中所產(chǎn)生的多功能的絲氨酸蛋白酶，可通過激活蛋白酶激活受體-1（protease-activated receptors-1，PAR-1）特異性地增加皮膚角質(zhì)形成細胞前腦啡肽mRNA的表達。事實上，阻塞性黃疸病程中凝血酶的生成增加，而在解除膽道梗阻后其合成也相應下降。在膽管結(jié)扎（bile duct-ligated, BDL）模型中，PAR-1拮抗劑可以防止肝纖維化的發(fā)生，這些證據(jù)都提示PAR-1受體在膽汁淤積性肝病病程中可能被激活，由此我們假設(shè)，在膽汁淤積性肝臟疾病中合成增加的凝血酶，可能通過激活PAR-1的下游信號通路，從而增加外周內(nèi)源性腦啡肽的合成。 在本研究中，我們首先觀察了阻塞性黃疸和非黃疸手術(shù)患者皮膚腦啡肽的表達情況。其次使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立BDL模型，測定PAR-1受體拮抗劑SCH79797對BDL大鼠痛閾值及血漿和皮膚腦啡肽表達水平的影響。再次，使用人角質(zhì)形成細胞系（HaCaT），觀察凝血酶和PAR-1受體特異性激動劑TFLLR-NH2對HaCaT細胞腦啡肽表達的影響，明確細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulatedprotein kinases1/2，ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）通路可能作用的細胞機制。實驗結(jié)果如下： 1.阻塞性黃疸患者皮膚角質(zhì)形成細胞腦啡肽表達水平升高 黃疸組患者與對照組患者的皮膚組織免疫組化分析顯示，，與對照組相比，黃疸組患者皮膚表皮棘細胞層和基底層角質(zhì)形成細胞中甲硫氨酸基腦啡肽的表達水平升高。 2. PAR-1受體拮抗劑降低BDL大鼠基礎(chǔ)痛閾值、血漿和皮膚角質(zhì)形成細胞的腦啡肽表達水平 按雙重結(jié)扎膽總管的方法建立大鼠BDL模型，BDL大鼠建模后6至8天，基礎(chǔ)熱痛閾值與機械性痛閾值均較術(shù)前基線值升高。在BDL大鼠建模后4至7天，連續(xù)梯度劑量皮下注射PAR-1受體拮抗劑SCH79797(0，0.3，1μg·kg-1·day-1)，觀察發(fā)現(xiàn)PAR-1受體拮抗劑SCH79797皮下注射（1μg·kg-1·day-1，4d）可顯著降低BDL大鼠建模后第8天的基礎(chǔ)熱痛閾值與機械性痛閾值，而相同劑量PAR-1受體拮抗劑對假手術(shù)組的基礎(chǔ)熱痛閾值與機械性痛閾值均無影響。 BDL大鼠模型建立8天后，Western blot和PCR檢測結(jié)果表明，與假手術(shù)對照組比較，皮膚組織腦啡肽原mRNA和蛋白表達在BDL組顯著升高。PAR-1受體拮抗劑SCH79797皮下注射（1μg·kg-1·day-1，4d）可顯著降低BDL組大鼠皮膚組織腦啡肽原的表達。大鼠后肢掌側(cè)皮膚免疫組織化學分析的結(jié)果表明，甲硫氨酸腦啡肽強烈表達于BDL大鼠皮膚表皮棘層至基底層的角質(zhì)形成細胞，而PAR-1拮抗劑處理（1μg·kg-1·day-1，4d）可顯著減少BDL組大鼠皮膚角質(zhì)形成細胞中甲硫氨酸-腦啡肽的表達。 放射免疫方法測定大鼠建模后第8天血漿甲硫氨酸腦啡肽濃度，BDL組大鼠較假手術(shù)組大鼠顯著升高。PAR-1受體拮抗劑處理組（1μg·kg-1·day-1，4d）血漿甲硫氨酸腦啡肽濃度較BDL組顯著降低，而PAR-1受體拮抗劑亞劑量組（0.3μg·kg-1·day-1，4d）血漿甲硫氨酸腦啡肽濃度與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學意義。 3.凝血酶通過作用于PAR-1受體誘導角質(zhì)形成細胞腦啡肽的表達 10%DMEM常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細胞，凝血酶以0.1，1和5U/ml的濃度分別孵育6和24h。RT-PCR檢測觀察凝血酶孵育對角質(zhì)形成細胞腦啡肽原、阿黑皮素原和強啡肽原mRNA表達的影響，結(jié)果表明凝血酶對腦啡肽原mRNA的表達呈劑量和時間依賴性增加，5U/ml凝血酶濃度孵育24h，可增加HaCaT細胞腦啡肽原mRNA表達約4.5倍。凝血酶在5U/ml的濃度孵育HaCaT細胞6或24小時對阿黑皮素原和強啡肽原mRNA的表達無影響。 由于凝血酶還可以激活PAR-3和PAR-4受體，因此我們使用TFLLR-NH2，PAR-1的特異性激動肽來證明凝血酶作用于PAR-1受體的特異性。TFLLR-NH2（100μM）孵育6小時能夠誘導HaCaT細胞腦啡肽原蛋白表達的量增加約3倍，而PAR-1受體拮抗劑SCH79797（5μM）與凝血酶（5U/ml）或TFLLR-NH2（100μM）共同孵育可消除后兩者對HaCaT細胞腦啡肽原蛋白表達的誘導作用。 4. PAR-1受體激活通過ERK1/2和p38MAPK通路誘導角質(zhì)形成細胞腦啡肽的表達 凝血酶(5U/mL)和PAR-1受體特異性激動劑TFLLR-NH2(100μM)孵育6小時可誘導HaCaT細胞ERK1/2和p38的磷酸化，且這一磷酸化作用可以被PAR-1受體拮抗劑SCH79797(5μM)所阻斷。為驗證ERK1/2和p38磷酸化是否參與了PAR-1激活誘導腦啡肽表達的過程，HaCaT細胞預先分別孵育ERK1/2和p38磷酸化抑制劑U0126（10μM）和SB203580（20μM）后，給以相同劑量凝血酶和PAR-1受體特異性激動劑TFLLR-NH2刺激。Westhern blot實驗顯示U0126和SB203580減弱了凝血酶和PAR-1受體激動劑誘導的腦啡肽原表達，表明PAR-1受體激活通過ERK1/2和p38MAPK通路磷酸化從而誘導角質(zhì)形成細胞腦啡肽的合成。 綜上所述，本研究的結(jié)果表明皮膚角質(zhì)形成細胞中腦啡肽的表達在阻塞性黃疸患者及膽道梗阻模型中均升高，這一結(jié)果可能與阻塞性黃疸病人基礎(chǔ)痛閾值升高相關(guān)。我們的實驗數(shù)據(jù)還表明，阻塞性黃疸病程中升高的凝血酶可通過作用于PAR-1受體而誘導角質(zhì)形成細胞內(nèi)源性腦啡肽合成的增加，這可能是膽汁淤積性肝臟疾病中外周組織內(nèi)源性阿片肽水平升高的機制之一。同時，我們的實驗結(jié)果提示，PAR-1受體激動劑是一個潛在的鎮(zhèn)痛藥物，而PAR-1受體拮抗劑可以被用來治療膽汁淤積患者內(nèi)源性阿片肽升高相關(guān)的并發(fā)癥。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：2419189