【摘要】：臨床研究表明膽汁淤積性肝臟疾病往往伴隨有血漿內(nèi)源性阿片肽水平的升高。在膽道梗阻患者和動(dòng)物模型的報(bào)道中，血漿內(nèi)源性甲硫氨酸腦啡肽的水平可升高至正常值的二到六倍。升高的內(nèi)源性阿片肽不僅會(huì)損害心血管、肝、腎功能，還可誘發(fā)劇烈的皮膚瘙癢等副反應(yīng)。在本課題組以前的研究中，我們還發(fā)現(xiàn)，阻塞性黃疸患者術(shù)中地氟醚、異氟醚和瑞芬太尼等的需求量較非黃疸患者顯著降低，提示上調(diào)的內(nèi)源性阿片肽水平可能也介導(dǎo)了黃疸患者基礎(chǔ)痛閾值的升高。然而，關(guān)于阻塞性黃疸患者內(nèi)源性阿片類(lèi)物質(zhì)合成增加的機(jī)制仍不明確。 最近對(duì)黃疸動(dòng)物模型的研究表明，人體最大的器官--皮膚腦啡肽合成增加可能在膽汁淤積性疾病內(nèi)源性阿片肽升高的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。正常人體皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞即可表達(dá)甲硫氨酸腦啡肽，且其表達(dá)可以通過(guò)化學(xué)或物理刺激上調(diào)。但至今還沒(méi)有臨床研究報(bào)告膽汁淤積患者皮膚腦啡肽的表達(dá)模式。先前的研究還表明，凝血酶，即在急性和慢性肝損傷過(guò)程中所產(chǎn)生的多功能的絲氨酸蛋白酶，可通過(guò)激活蛋白酶激活受體-1（protease-activated receptors-1，PAR-1）特異性地增加皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞前腦啡肽mRNA的表達(dá)。事實(shí)上，阻塞性黃疸病程中凝血酶的生成增加，而在解除膽道梗阻后其合成也相應(yīng)下降。在膽管結(jié)扎（bile duct-ligated, BDL）模型中，PAR-1拮抗劑可以防止肝纖維化的發(fā)生，這些證據(jù)都提示PAR-1受體在膽汁淤積性肝病病程中可能被激活，由此我們假設(shè)，在膽汁淤積性肝臟疾病中合成增加的凝血酶，可能通過(guò)激活PAR-1的下游信號(hào)通路，從而增加外周內(nèi)源性腦啡肽的合成。 在本研究中，我們首先觀察了阻塞性黃疸和非黃疸手術(shù)患者皮膚腦啡肽的表達(dá)情況。其次使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立BDL模型，測(cè)定PAR-1受體拮抗劑SCH79797對(duì)BDL大鼠痛閾值及血漿和皮膚腦啡肽表達(dá)水平的影響。再次，使用人角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT），觀察凝血酶和PAR-1受體特異性激動(dòng)劑TFLLR-NH2對(duì)HaCaT細(xì)胞腦啡肽表達(dá)的影響，明確細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulatedprotein kinases1/2，ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）通路可能作用的細(xì)胞機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.阻塞性黃疸患者皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞腦啡肽表達(dá)水平升高 黃疸組患者與對(duì)照組患者的皮膚組織免疫組化分析顯示，，與對(duì)照組相比，黃疸組患者皮膚表皮棘細(xì)胞層和基底層角質(zhì)形成細(xì)胞中甲硫氨酸基腦啡肽的表達(dá)水平升高。 2. PAR-1受體拮抗劑降低BDL大鼠基礎(chǔ)痛閾值、血漿和皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的腦啡肽表達(dá)水平 按雙重結(jié)扎膽總管的方法建立大鼠BDL模型，BDL大鼠建模后6至8天，基礎(chǔ)熱痛閾值與機(jī)械性痛閾值均較術(shù)前基線值升高。在BDL大鼠建模后4至7天，連續(xù)梯度劑量皮下注射PAR-1受體拮抗劑SCH79797(0，0.3，1μg·kg-1·day-1)，觀察發(fā)現(xiàn)PAR-1受體拮抗劑SCH79797皮下注射（1μg·kg-1·day-1，4d）可顯著降低BDL大鼠建模后第8天的基礎(chǔ)熱痛閾值與機(jī)械性痛閾值，而相同劑量PAR-1受體拮抗劑對(duì)假手術(shù)組的基礎(chǔ)熱痛閾值與機(jī)械性痛閾值均無(wú)影響。 BDL大鼠模型建立8天后，Western blot和PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與假手術(shù)對(duì)照組比較，皮膚組織腦啡肽原mRNA和蛋白表達(dá)在BDL組顯著升高。PAR-1受體拮抗劑SCH79797皮下注射（1μg·kg-1·day-1，4d）可顯著降低BDL組大鼠皮膚組織腦啡肽原的表達(dá)。大鼠后肢掌側(cè)皮膚免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果表明，甲硫氨酸腦啡肽強(qiáng)烈表達(dá)于BDL大鼠皮膚表皮棘層至基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞，而PAR-1拮抗劑處理（1μg·kg-1·day-1，4d）可顯著減少BDL組大鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中甲硫氨酸-腦啡肽的表達(dá)。 放射免疫方法測(cè)定大鼠建模后第8天血漿甲硫氨酸腦啡肽濃度，BDL組大鼠較假手術(shù)組大鼠顯著升高。PAR-1受體拮抗劑處理組（1μg·kg-1·day-1，4d）血漿甲硫氨酸腦啡肽濃度較BDL組顯著降低，而PAR-1受體拮抗劑亞劑量組（0.3μg·kg-1·day-1，4d）血漿甲硫氨酸腦啡肽濃度與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.凝血酶通過(guò)作用于PAR-1受體誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞腦啡肽的表達(dá) 10%DMEM常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，凝血酶以0.1，1和5U/ml的濃度分別孵育6和24h。RT-PCR檢測(cè)觀察凝血酶孵育對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞腦啡肽原、阿黑皮素原和強(qiáng)啡肽原mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明凝血酶對(duì)腦啡肽原mRNA的表達(dá)呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性增加，5U/ml凝血酶濃度孵育24h，可增加HaCaT細(xì)胞腦啡肽原mRNA表達(dá)約4.5倍。凝血酶在5U/ml的濃度孵育HaCaT細(xì)胞6或24小時(shí)對(duì)阿黑皮素原和強(qiáng)啡肽原mRNA的表達(dá)無(wú)影響。 由于凝血酶還可以激活PAR-3和PAR-4受體，因此我們使用TFLLR-NH2，PAR-1的特異性激動(dòng)肽來(lái)證明凝血酶作用于PAR-1受體的特異性。TFLLR-NH2（100μM）孵育6小時(shí)能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞腦啡肽原蛋白表達(dá)的量增加約3倍，而PAR-1受體拮抗劑SCH79797（5μM）與凝血酶（5U/ml）或TFLLR-NH2（100μM）共同孵育可消除后兩者對(duì)HaCaT細(xì)胞腦啡肽原蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用。 4. PAR-1受體激活通過(guò)ERK1/2和p38MAPK通路誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞腦啡肽的表達(dá) 凝血酶(5U/mL)和PAR-1受體特異性激動(dòng)劑TFLLR-NH2(100μM)孵育6小時(shí)可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞ERK1/2和p38的磷酸化，且這一磷酸化作用可以被PAR-1受體拮抗劑SCH79797(5μM)所阻斷。為驗(yàn)證ERK1/2和p38磷酸化是否參與了PAR-1激活誘導(dǎo)腦啡肽表達(dá)的過(guò)程，HaCaT細(xì)胞預(yù)先分別孵育ERK1/2和p38磷酸化抑制劑U0126（10μM）和SB203580（20μM）后，給以相同劑量凝血酶和PAR-1受體特異性激動(dòng)劑TFLLR-NH2刺激。Westhern blot實(shí)驗(yàn)顯示U0126和SB203580減弱了凝血酶和PAR-1受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的腦啡肽原表達(dá)，表明PAR-1受體激活通過(guò)ERK1/2和p38MAPK通路磷酸化從而誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞腦啡肽的合成。 綜上所述，本研究的結(jié)果表明皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中腦啡肽的表達(dá)在阻塞性黃疸患者及膽道梗阻模型中均升高，這一結(jié)果可能與阻塞性黃疸病人基礎(chǔ)痛閾值升高相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，阻塞性黃疸病程中升高的凝血酶可通過(guò)作用于PAR-1受體而誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)源性腦啡肽合成的增加，這可能是膽汁淤積性肝臟疾病中外周組織內(nèi)源性阿片肽水平升高的機(jī)制之一。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PAR-1受體激動(dòng)劑是一個(gè)潛在的鎮(zhèn)痛藥物，而PAR-1受體拮抗劑可以被用來(lái)治療膽汁淤積患者內(nèi)源性阿片肽升高相關(guān)的并發(fā)癥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2419189