發(fā)布時間：2019-02-09 12:16

【摘要】：目的:膽管病(Cholangiopathies)泛指以膽管上皮細胞(biliary epithelial cells,BECs)為主要攻擊靶點的一類疾病,其本質是膽管上皮細胞受損后,上皮化的功能單位發(fā)生改建和纖維化。研究表明膽管纖維化常伴隨膽道的慢性感染。Toll樣受體4(Toll-like recepter,TLR4)作為炎癥反應調節(jié)及細胞信號傳導的關鍵,其本身又是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的天然受體。我們在前期的研究中發(fā)現TLR4可參與活化并激活由LPS介導的膽管上皮細胞發(fā)生EMT現象,但其具體機制尚有待研究。TLR4是否是BECs發(fā)生EMT的關鍵節(jié)點,以及下調TLR4能否抑制EMT,從而阻止膽道纖維化的發(fā)展?這一問題已成為研究的熱點。本研究旨在通過針對人膽管上皮細胞(human biliary epithelial cell lines,HIBEip C)TLR4的小干擾RNA病毒載體(LV-TLR4-RNAi),體外對HIBEpi C進行轉染實驗,降低TLR4 m RNA表達,觀察LPS介導的EMT逆轉情況。探討LPS介導的EMT過程中,TLR4可能扮演的角色,以及核轉錄因子snail在EMT中可能發(fā)揮的調控作用。以期為以膽管纖維化為主要特點的膽道疾病的臨床藥物治療尋找新的靶點,和提供新的思路。方法:將購買的人膽管上皮細胞株(human biliary epithelial cell lines,HIBEpi C)進行培養(yǎng)后,分別設立①control組(未感染任何病毒的正常細胞組);②control+LPS組(LPS誘導未感染病毒細胞組);③NC+LPS組(negative control+LPS,LPS誘導陰性對照病毒感染組)進行實驗;④KD+LPS組(knock down+LPS,LPS誘導RNAi靶點病毒感染組)。②組將正常HIBEpi C與LPS共同培養(yǎng);④組將TLR4的小干擾RNA病毒載體LV-TLR4-RNAi轉染至正常HIBEpi C,收集感染率80%的細胞與LPS共同培養(yǎng);③組用陰性病毒CON077相同步驟進行細胞轉染和LPS刺激。分別取0h、14h、24h、48h和72h等不同時相點,通過熒光定量PCR檢測轉染前后,膽管上皮細胞E-cadherin、TLR4和snail m RNA水平表達變化情況。①、②、③、④組分別進行兩兩比較,結果用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,P0.05表示有統(tǒng)計學差異。結果:1.LPS誘導正常HIBEpi C,14h、24h、48h、72h后細胞間排列變得松散,細胞呈現長梭形改變,細胞突起增多。隨誘導時間延長,細胞形態(tài)越接近成纖維細胞樣形態(tài)。而刺激慢病毒轉染后的HIBEpi C,相同時相觀察細胞接近正常上皮樣細胞形態(tài),細胞大小基本一致,細胞形態(tài)各異,呈圓形、橢圓形、多邊形等。提示:TLR4-si RNA可抑制LPS誘導的HIBEpi C發(fā)生EMT。2.LPS刺激HIBEpi C后14h即可檢測到TLR4 m RNA表達量較正常HIBEpi C明顯升高(P0.01),隨培養(yǎng)時間延長,一直維持在較高水平。而④組經LV-TLR4-RNAi病毒轉染的HIBEpi C,在LPS刺激下可檢測到TLR4 m RNA表達下降,0h、14h、24h、48h和72h敲減效率分別為73.5%、81.5%、89.9%、93.9%和82.6%;LPS刺激TLR4-si RNA后的HIBEpi C,0h即出現TLR4 m RNA表達量較③組明顯下降,至72h未見升高趨勢(P0.01)。結果說明病毒轉染成功,TLR4-si RNA可特異性沉默TLR4m RNA表達。3.LPS刺激HIBEpi C,14h后可觀察到鋅指轉錄因子snail較正常細胞的表達量升高,繼續(xù)培養(yǎng)至24h、48h,其表達仍維持較高水平(P0.01)。同樣與③組比較,TLR4-si RNA的HIBEpi C,snail的表達隨培養(yǎng)時間的延長,表達量降低,14h、24h、48h最明顯(P0.01)。說明TLR4-si RNA可下調snail在HIBEpi C上的表達。4.LPS刺激可誘導HIBEpi C發(fā)生EMT現象,主要表現為上皮標志物E-cadherin在轉錄水平受到明顯抑制,②組經LPS刺激,14h起至72h內,可觀察到E-cadherin表達持續(xù)下降(P0.01)。而在TLR4-si RNA干擾后,與③組間比較,TLR4被阻斷14~48h均能檢測到E-cadherin的表達量出現上調(P0.01)。說明TLR4-si RNA干擾后可抑制E-cadherin下調。5.LPS刺激陰性對照病毒轉染后的HIBEpi C,各時相點檢測到的EMT相關目的基因表達情況與②組表達情況基本相符,P0.05差異無統(tǒng)計學意義。說明病毒載體本身對本實驗結果無影響。結論：1.通過RNA干擾技術沉默TLR4基因表達,可有效抑制LPS誘導的膽管上皮細胞發(fā)生EMT表型轉化;2.沉默TLR4的HIBEpi C中,上皮標志物明顯升高,EMT現象受到了明顯的抑制;3.轉錄因子snail是EMT過程中重要的信號分子,在模擬的膽道感染的微環(huán)境中,其表達也受到TLR4的調控;4.TLR4可作為早期調控膽管上皮細胞EMT、抑制膽道纖維化進程的藥物治療靶點,對膽道結石、膽道感染所致的膽管纖維化防治有重要的潛在治療前景。
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【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.7

【參考文獻】

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1 趙禮金;楊日高;程龍;王麥建;江艷;余德剛;周廷梅;王曙光;;肝內膽管上皮細胞上皮-間葉轉化的實驗研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2010年03期

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本文編號：2418948