【摘要】：隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高,肝臟手術(shù)在很多醫(yī)院已常規(guī)開展。手術(shù)過程中對肝臟血流的阻斷可能導(dǎo)致一種常見病理現(xiàn)象--缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)。其概念于1960年首次由Jennings提出,其定義是缺血的組織器官重新獲得血液供應(yīng)后,組織、器官功能并沒有得以恢復(fù),其功能代謝障礙及組織結(jié)構(gòu)破壞程度反而加重的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷是常見的臨床病理現(xiàn)象,涉及機(jī)體創(chuàng)傷與失血性休克、心臟冠狀動脈缺血、心臟體外循環(huán)手術(shù)、肝臟部分切除術(shù)以及肝、腎臟等器官移植手術(shù)等,可嚴(yán)重影響疾病的預(yù)后,但由于對IRI發(fā)生的分子機(jī)制仍然缺乏深刻的研究,限制了臨床防治方法的研究及實(shí)施。IR損傷的機(jī)制復(fù)雜,分為缺血及再灌注二個過程；首先,缺血過程中由于缺氧后線粒體功能受損及ATP耗竭,造成能量代謝障礙、鈣超載以及細(xì)胞凋亡等為主的損傷；其次,再灌注后主要涉及氧自由基釋放造成蛋白和核酸的損傷,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及凋亡損傷的進(jìn)一步加重。另外,由于社會經(jīng)濟(jì)水平的提高,以發(fā)達(dá)國家為主的,包括中國等發(fā)展中國家在內(nèi)的許多國家,肥胖患者越來越多,同時(shí)帶來的患有包括脂肪肝、高血壓、糖尿病等慢性在內(nèi)的患者也越來越常見,增加了國家衛(wèi)生開支負(fù)擔(dān)。目前在全球范圍內(nèi)非酒精性脂肪肝已成為一種常見的慢性疾病。我們無論在臨床上還是理論研究上都發(fā)現(xiàn),非酒精性脂肪肝患者在肝臟手術(shù)或者肝移植手術(shù)后發(fā)生并發(fā)癥的概率較高,損傷較嚴(yán)重,且預(yù)后較差。肝臟尤其是非酒精性脂肪肝移植過程中,器官的獲取和移植過程中產(chǎn)生的IR損傷可導(dǎo)致移植物無功能或功能延遲恢復(fù),并增加移植物急、慢性排斥的發(fā)生率,影響移植物的中遠(yuǎn)期存活率。因此,如何有效的緩解和減輕肝臟,尤其是脂肪肝IR損傷,以及如何更好的保護(hù)供體器官,都是急待解決的課題。脂肪肝缺血再灌注損傷的主要機(jī)制包括脂質(zhì)過氧化及炎癥因子的分泌增多,從而加重肝臟損傷。脂質(zhì)的過氧化造成肝臟組織的損傷的同時(shí)也可刺激炎性因子的分泌。另外,肝臟內(nèi)定居的巨噬細(xì)胞--Kupffer細(xì)胞在脂肪肝缺血再灌注損傷中起到了至關(guān)重要的作用。在脂肪肝形成的過程中,Kupffer細(xì)胞逐漸被激活,分泌炎癥因子造成肝臟損傷,而在IR刺激下,Kupffer細(xì)胞進(jìn)一步地被激活,分泌大量超氧化物、腫瘤壞死因子及細(xì)胞因子,從而造成肝臟組織更為嚴(yán)重的損傷。因此,如何能抑制Kupffer細(xì)胞的活化,降低Kupffer細(xì)胞的活性有效減輕包括脂肪肝在內(nèi)的肝臟缺血再灌注損傷是我們需要研究的一個重要靶點(diǎn)。肝臟的缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程。包括T細(xì)胞等在內(nèi)的許多免疫細(xì)胞及其相關(guān)靶點(diǎn)、肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞、炎癥介質(zhì)及缺血預(yù)處理等都被用于研究如何減輕肝臟的缺血再灌注損傷。另外,許多藥物,包括甲基強(qiáng)的松龍、曲美他嗪、葡萄糖和烏司他丁也被作為藥物預(yù)處理保護(hù)肝臟,減輕缺血再灌注損傷。當(dāng)然,很多藥物的使用及其效果還存在爭議,而且它們的使用尚缺乏有效的臨床試驗(yàn),故其臨床使用受到了一定的限制。但其作為一種有效的、經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理手段,有進(jìn)一步研究的意義。紅曲黃素作為一種傳統(tǒng)的食品染色劑、食品添加劑在包括中國在內(nèi)的東亞國家已使用近百年。目前對于其研究發(fā)現(xiàn)其能有效的減輕肥胖、抑制腫瘤及抑制炎癥,具有預(yù)防心血管疾病及脂肪肝的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)紅曲黃素能抑制脂肪酸的腸道吸收并增加脂肪酸細(xì)胞內(nèi)的β氧化,從而減少血漿中甘油三酯、膽固醇及游離脂肪酸,改善高脂血癥。最近的研究發(fā)現(xiàn),其還能有效減少炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1β等的表達(dá)�；谝陨蟽�(nèi)容,我們在本課題中研究了紅曲黃素與脂肪肝IR之間的相互關(guān)系及其對脂肪肝IR損傷調(diào)控的可能的相關(guān)機(jī)制。一、紅曲黃素對脂肪肝形成的影響為了探討紅曲黃素對脂肪肝形成的影響,我們構(gòu)建小鼠脂肪肝模型。為了模仿人類脂肪肝形成過程,我們給予小鼠高脂飲食(60%的能量由脂肪提供)4周,肝臟穿刺病理明確形成脂肪肝模型。取小鼠肝組織蘇木精-伊紅(HE)染色評價(jià)肝臟中脂肪浸潤情況。MetaMorph軟件分析脂肪肝脂質(zhì)浸潤區(qū)域百分比。我們研究發(fā)現(xiàn)小鼠喂養(yǎng)紅曲黃素后明顯減輕了脂肪肝的發(fā)生,其脂肪浸潤區(qū)域比率由31%下降致11%。另外,取小鼠血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)評價(jià)肝臟損傷情況。脂肪肝的形成過程對肝臟功能有所損傷,故脂肪肝形成后可出現(xiàn)ALT明顯升高,而紅曲黃素的使用能有效的降低血清ALT。這些都說明,紅曲黃素的使用能有效的緩解脂肪肝形成,并減輕脂肪肝對肝功能的損害。二、紅曲黃素對脂肪肝IR損傷的作用為了進(jìn)一步探討紅曲黃素對脂肪肝IR損傷的影響,我們采用小鼠部分肝臟IR損傷模型(70%肝組織缺血),觀察IR損傷后小鼠肝臟細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過氧化及血清ALT、AST的變化情況。小鼠缺血60分鐘后,取再灌注(血流開放)后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟組織,我們研究發(fā)現(xiàn)小鼠再灌注3小時(shí)后其血清ALT及AST的變化達(dá)到峰值,故我們選取再灌注3小時(shí)作為后續(xù)觀察時(shí)間點(diǎn)。血清ALT、AST的表達(dá)用于初步判斷及評估IR損傷的程度。我們研究表明從血清ALT、AST指標(biāo)方面,紅曲黃素能明顯減輕脂肪肝的IR損傷。肝臟細(xì)胞凋亡是另外的一個觀察IR損傷的指標(biāo)。因此我們利用流式細(xì)胞儀計(jì)算肝臟細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示在給與高脂飲食小鼠口服紅曲黃素后,肝細(xì)胞凋亡率及壞死從34.05%下降至13.66%,表明紅曲黃素能有效的減少脂肪肝細(xì)胞的凋亡及壞死。最后在脂質(zhì)氧化應(yīng)激方面,我們采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(TBARS)檢測肝組織氧化應(yīng)激水平。同樣紅曲黃素能有效的降低脂肪肝氧化應(yīng)激水平。因此從肝酶指標(biāo)、細(xì)胞凋亡及壞死率及氧化應(yīng)激等方面,我們認(rèn)為紅曲黃素能有效降低脂肪肝的IR損傷。三、紅曲黃素對脂肪肝IR損傷后炎癥水平的作用為評價(jià)脂肪肝IR損傷前后炎癥水平的改變,我們從動物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)兩方面進(jìn)行評估。首先在動物實(shí)驗(yàn)方面,我們采用小鼠部分肝臟IR模型(70%肝組織缺血),觀察再灌注3小時(shí)小鼠肝組織TNF-α、IL-6及IL-1βmRNA水平。正如預(yù)想的一樣,紅曲黃素能有效的降低上述炎癥因子的mRNA水平。我們進(jìn)一步利用F4/80免疫組化標(biāo)記IR損傷后肝組織切片內(nèi)活化的Kupffer細(xì)胞數(shù)量。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)小鼠給與口服紅曲黃素以后,脂肪肝IR損傷后Kupffer細(xì)胞活化的數(shù)量明顯減少,從而減少了肝臟的炎性損傷。其次在體外實(shí)驗(yàn)方面,我們從正常小鼠及高脂飲食脂肪肝小鼠肝臟內(nèi)分離原代Kupffer細(xì)胞。TNF-a刺激原代分離Kupffer細(xì)胞,用或不用紅曲黃素共培養(yǎng),并用ELISA法檢測上清液中TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示紅曲黃素能體外水平有效的減少上述炎癥因子的蛋白表達(dá)。綜上所述,紅曲黃素作為我們常用的食品添加劑及著色劑,能有效減輕高脂飲食引起的脂肪肝,并能減輕脂肪肝IR損傷后氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及壞死、降低Kupffer細(xì)胞活性,減少其炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1β的表達(dá)。本課題首次闡明紅曲黃素對脂肪肝IR損傷的保護(hù)作用,并初步探討了其主要機(jī)制為抑制Kupffer細(xì)胞活性及減少其相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1p的表達(dá),具有理論意義及潛在的研究及應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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