【摘要】：研究背景肝纖維化是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織合成分泌異常增多,導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(fibrillar extracellular matrix, ECM)過度沉積的持續(xù)性病理改變過程,也是多種肝臟疾病向肝硬化甚至肝癌等進一步發(fā)展的重要中間環(huán)節(jié)。據(jù)報道,我國肝硬化的發(fā)病率約為同時期住院患者總數(shù)的1%,占所有死亡原因的第六位,對社會醫(yī)療保健事業(yè)影響重大。基礎(chǔ)及臨床研究已經(jīng)證實,肝纖維化是一個可逆過程。盡管早期診斷并及時干預(yù)原發(fā)病所致的肝臟炎癥性壞死,可在一定程度上防止肝纖維化的發(fā)展,但目前尚無療效肯定的直接抗肝纖維化藥物。因此,為更好地研究肝纖維化的發(fā)生機制、探索相關(guān)藥物在治療肝纖維化時的合理給藥途徑并驗證其療效,建立穩(wěn)定可靠的肝纖維化動物模型具有重要意義。傳統(tǒng)的肝纖維化模型一般以小鼠、大鼠或家兔為實驗動物,所建立的肝纖維化模型包括中毒性肝損傷模型、膽汁淤積性肝損傷模型、免疫性肝損傷模型及轉(zhuǎn)基因動物模型等。與傳統(tǒng)實驗動物相比,斑馬魚具有飼養(yǎng)管理經(jīng)濟方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、樣本獲取簡便、分子遺傳操作簡單易行等優(yōu)點,很好地彌補了傳統(tǒng)動物模型實驗耗費高、樣本量相對局限、建模操作復(fù)雜等不足�；谖锓N自身特點,中毒性肝損傷法和轉(zhuǎn)基因法在誘導(dǎo)建立斑馬魚肝纖維化模型時具備更強的可行性。而相較于轉(zhuǎn)基因法,藥物誘導(dǎo)建立肝纖維化模型的方法技術(shù)難度較小、實驗周期短。二乙基亞硝胺(DEN)是一種具有細胞毒性的致癌劑,具有明顯的肝臟親和性。DEN經(jīng)微粒體轉(zhuǎn)化后,可引起核酸和蛋白質(zhì)等大分子甲基化,導(dǎo)致肝細胞壞死,刺激肝內(nèi)ECM的合成與分泌,從而促進纖維化的形成。此外,DEN為水溶性物質(zhì),在室溫下理化性質(zhì)較穩(wěn)定,符合建立斑馬魚模型的藥物條件且能夠采用直接浸泡的方式給藥。因此,本研究采用DEN肝毒性藥物誘導(dǎo)斑馬魚肝臟纖維化的形成。ECM的過度沉積是肝纖維化形成的基礎(chǔ),當肝臟受到外源性刺激損傷時,肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝內(nèi)ECM合成與分泌的主要細胞。由于斑馬魚體型小,肝臟組織細胞含量少,斑馬魚HSCs原代分離技術(shù)難度高,因此,在細胞水平研究野生型斑馬魚肝纖維化的發(fā)病機制不易實現(xiàn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),嘌呤信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)與斑馬魚肝臟疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系,且報道顯示嘌呤信號通路和ER stress參與調(diào)控肝纖維化的疾病進展。因此,本研究擬利用Real-time RT-PCR方法檢測上述信號通路相關(guān)基因的表達水平,從而初步探討斑馬魚肝纖維化的發(fā)病機制。CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種由RNA指導(dǎo)Cas9蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù),能夠誘導(dǎo)DNA損傷,并在DNA靶位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks, DSBs)。 DSBs能夠激活細胞內(nèi)固有的非同源末端連接(Non-homologous end-ing-joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recom-bination, HR)兩種修復(fù)機制,從而實現(xiàn)基因組定點編輯。目前,該技術(shù)已成功應(yīng)用于人類細胞、細菌、植物以及斑馬魚等生物的遺傳學(xué)改造。根據(jù)斑馬魚肝纖維化發(fā)病機制的初步探討結(jié)果,本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對參與斑馬魚肝纖維化形成的關(guān)鍵基因進行基因組定點修飾,嘗試構(gòu)建關(guān)鍵基因敲除的斑馬魚突變體,從而探討相關(guān)基因缺失對DEN誘導(dǎo)斑馬魚肝纖維化疾病的影響,這將為抗纖維化靶向新藥的研發(fā)提供穩(wěn)定可靠的模式生物奠定實驗基礎(chǔ)。目的嘗試利用DEN致中毒性肝損傷的方法構(gòu)建斑馬魚肝纖維化模型,并評估該模型的可行性與穩(wěn)定性。分別由嘌呤信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激入手,初步探討斑馬魚肝纖維化的發(fā)生機制。采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對相關(guān)通路中關(guān)鍵基因進行定點修飾,探討關(guān)鍵基因缺失對斑馬魚肝纖維化的影響,為深入探討肝纖維化的發(fā)病機制、尋找切實有效的抗纖維化藥物提供新的研究思路與方向。材料與方法1、實驗動物3月齡健康A(chǔ)B品系野生型(Wild-type AB strain)斑馬魚(Danio rerio),由南方醫(yī)科大學(xué)廣東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選重點實驗室惠贈。按照Westerfield方法養(yǎng)殖斑馬魚,光照周期維持時間為L:D=14h:10h,溫度控制在28.5℃C。2、斑馬魚二乙基亞硝胺(DEN)處理將斑馬魚隨機分為DEN處理組及對照組(60條／組),分別飼養(yǎng)于不同的魚缸中。DEN處理組于飼養(yǎng)缸中直接投放藥物,每2周更換缸內(nèi)液體1次,并于浸泡后第2、4、6周末分別隨機選取各組斑馬魚(20條／組)檢測相關(guān)指標以評估肝纖維化病變的進展。3、斑馬魚身長、體重、體重質(zhì)量指數(shù)(BMI)和肝臟指數(shù)的檢測分別于造模2、4、6周末測量斑馬魚身長(cm)和體重(g),在顯微鏡下迅速解剖分離其肝臟組織,并稱量肝組織濕重(g),計算BMI及肝臟指數(shù)。4、肝臟組織病理切片4%多聚甲醛固定斑馬魚5天,不同濃度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟后包埋,4μm切片,行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)、Gomori氏網(wǎng)狀纖維以及天狼星紅苦味酸病理染色,Olympus BX51光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。5、Real time RT-PCR方法檢測基因表達水平Trizol法提取斑馬魚肝臟RNA,利用紫外分光光度法(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, USA)測定RNA濃度及純度；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; Real time RT-PCR反應(yīng)采用LightCycler(?)Nano進行檢測。6、CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚突變體根據(jù)基因組序列設(shè)計sgRNA;以pXT7-hcas9載體為模板體外轉(zhuǎn)錄Cas9mRNA (T7 mMESSAGE mMACHINE(?) Kit, Ambion);將Cas9 mRNA與sgRNA按一定的比例預(yù)混(300ng/ul～500ng/ul;100ng/ul～300ng/ul),收集單細胞受精卵用于顯微注射,于注射24小時利用酶切法檢測靶點突變效率,選取突變效率和存活率較高的同批次注射F0胚胎飼養(yǎng)至性成熟,用于檢測、篩選F0生殖細胞遺傳性。將具有潛在突變的F0與WT斑馬魚外交獲得F1代胚胎,將其飼養(yǎng)至性成熟后酶切法和測序檢測F1突變類型。7、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示�？紤]到DEN處理和處理時間兩個因素的作用,在分析DEN對基因表達的影響時采用雙向方差分析(two-way ANOVA)檢驗,各組均數(shù)多重比較采用LSD法(least-significant difference test);若方差不齊,多重比較采用Dunnett's T3法；兩組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗。用Sigmaplot10.0軟件作圖。P0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、DEN處理后斑馬魚的一般情況與對照組相比,DEN處理組斑馬魚在藥物誘導(dǎo)后第1周內(nèi),食欲明顯減退,游動減少,第2周起食欲逐漸增加,游動亦增多,考慮系斑馬魚對DEN逐漸耐受所致。實驗過程中,DEN處理組與對照組斑馬魚體表、魚腮等處鱗片光滑,均未見立鱗、爛鰓、出血以及潰瘍等形態(tài)學(xué)異常。2、DEN處理后斑馬魚的生長發(fā)育情況分別在造模2周、4周和6周末檢測斑馬魚身長、體重、BMI以及肝指數(shù),結(jié)果顯示,斑馬魚身長和肝指數(shù)在DEN處理組與對照組間未見明顯差異；體重和BMI在6周造模結(jié)束時處理組斑馬魚較對照組明顯減輕(P0.05)。結(jié)果提示隨著DEN處理時間的延長,斑馬魚生長發(fā)育受限。3、DEN對斑馬魚肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響光鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變,結(jié)果顯示造模期間對照組斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)完整,肝細胞排列整齊,未見肝炎、纖維結(jié)締組織異常增多等病理改變；DEN處理組斑馬魚于2周末肝臟輕度炎癥反應(yīng),炎性細胞少量浸潤,未見明顯增生的纖維組織；4周末肝細胞變性壞死,局部可見壞死灶,網(wǎng)狀纖維合成分泌增多,未見膠原纖維異常增多；6周末肝臟結(jié)構(gòu)紊亂,纖維結(jié)節(jié)形成,網(wǎng)狀纖維和膠原纖維過度沉積。提示斑馬魚肝纖維化形成早期以網(wǎng)狀纖維合成分泌為主,隨著疾病進展膠原纖維也逐漸增多。4、斑馬魚肝臟炎癥反應(yīng)和肝纖維化的發(fā)生率隨著DEN處理時間延長,斑馬魚肝臟炎癥反應(yīng)發(fā)生率分別為60%(2周)、80%(4周)及100%(6周),肝纖維化的發(fā)生率則由30%(4周)增加到80%(6周),提示DEN對斑馬魚肝臟損傷嚴重程度具有時間依賴性。5、斑馬魚肝纖維化相關(guān)指標的表達情況利用Real-time RT-PCR方法檢測肝纖維化相關(guān)基因Acta2、Collα1、TGF-β、 MMP9和TIMP1 mRNA的表達水平,結(jié)果顯示造模期間處理組Acta2、Collα1、 TGF-β、MMP9和TIMP1 mRNA均較對照組表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),進一步證明采用DEN誘導(dǎo)斑馬魚肝纖維化的建模方法效果穩(wěn)定可靠。6、斑馬魚肝纖維化發(fā)病機制的初步探討結(jié)果利用Real-time RT-PCR方法檢測嘌呤信號通路、ER stress及其介導(dǎo)的凋亡和自噬途徑相關(guān)基因的表達水平,結(jié)果顯示,腺苷生成關(guān)鍵酶CD73參與斑馬魚肝纖維化的形成；而腺苷受體A1、A2aa、A2ab和A2b的表達水平在DEN處理組和對照組間未見明顯差異。結(jié)果提示CD73調(diào)控斑馬魚肝纖維化的疾病進展可能與嘌呤信號通路無關(guān)。此外,ER stress也參與其中,DEN處理組ER stress相關(guān)基因BiP/GRP78、 PERK、ATF6、IRE1和CHOP的mRNA表達水平均較對照組表達上調(diào)(P0.05)。進一步檢測ER stress介導(dǎo)的凋亡和自噬途徑相關(guān)基因的表達,結(jié)果顯示凋亡家族分子Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表達水平在兩組間未見明顯差異,且抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表達水平在處理組中較對照組明顯上調(diào),提示凋亡途徑可能不參與調(diào)控斑馬魚肝纖維化的疾病發(fā)生；而自噬相關(guān)基因Atg3、Atgl2和Beclin1的nRNA表達水平在處理組中較對照組表達明顯上調(diào)(P0.05)。結(jié)果提示ER stress介導(dǎo)的自噬途徑可能參與調(diào)控斑馬魚肝纖維化的形成。7、CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚BiP/GRP78和CD73突變體基于斑馬魚肝纖維化發(fā)病機制的初步研究,目前本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對斑馬魚形成的關(guān)鍵基因CD73和BiP/GRP78進行定點修飾,并采用酶切法檢測突變效率,結(jié)果顯示BiP/GRP78靶點(GGTCGAAGTCTTCTCCGCCC)無突變效率；CD73靶點(GGACGCAGGAGACCAGTTCC)突變效率最高約為20%,然而該靶點相應(yīng)的FO未發(fā)現(xiàn)生殖細胞具有遺傳性；CD73靶點(GGTGGATCTCCGCGACACTC)突變效率最高約為50%,且FO生殖細胞具有遺傳性,將相應(yīng)的子代F1飼養(yǎng)長大后利用酶切法和測序鑒定其突變類型。結(jié)論1、利用DEN誘導(dǎo)斑馬魚肝纖維化的建模方法效果穩(wěn)定可靠,該方法所建立的斑馬魚肝纖維化模型可為肝纖維化發(fā)病機制的研究以及相應(yīng)治療藥物的篩選提供穩(wěn)定的實驗基礎(chǔ)。2、發(fā)現(xiàn)腺苷生成關(guān)鍵酶CD73以及ER stress介導(dǎo)的自噬途徑可能參與調(diào)控斑馬魚肝纖維化的疾病進展,為深入探討肝纖維化的發(fā)病機制提供了新的思路和方向。3、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功獲得生殖細胞可遺傳的CD73 F0代斑馬魚,潛在具有突變效率的CD73 F1代斑馬魚正在飼養(yǎng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的成功應(yīng)用將為肝纖維化靶向新藥的研發(fā)提供遺傳背景穩(wěn)定可靠的模式生物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2;R-332

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本文編號：2325035