【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是胰腺的急性炎癥性病變,可以由高脂血癥、酗酒和膽系疾病等多種病因導致。AP既可以表現(xiàn)為一般的輕度水腫型炎癥,也可以表現(xiàn)為具有致命性的重癥炎癥。根據(jù)AP患者的局部或全身并發(fā)癥以及是否存在一過性或持續(xù)性臟器衰竭情況,可以將AP患者分為輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)、中度重癥急性胰腺炎(moderate severe acute pancreatitis,MSAP)和重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。AP患者的預后差異很大,MAP的預后較好,病死率接近0%,而SAP病情嚴重,預后較差。SAP的特征是患者伴有持續(xù)性臟器衰竭,即臟器衰竭時間超過48h。在所有AP患者中10%~20%可能出現(xiàn)持續(xù)性臟器衰竭,患者死亡率可以達到30%~50%。miRNAs是一類高度保守的短鏈非編碼RNA,其長度約為17-25個核苷酸,可以在轉錄后水平調(diào)節(jié)目的基因的表達。miRNAs通過堿基互補配對與編碼蛋白的m RNA的3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)相結合,負性調(diào)控靶基因的表達水平。據(jù)估計miRNAs對哺乳動物超過30%的蛋白編碼基因具有活性調(diào)控作用。由于miRNAs在基因調(diào)控中具有重要的作用,其表達水平在眾多生理、病理條件下均有顯著改變。在多種疾病的發(fā)生過程中,miRNAs在病變組織或循環(huán)血等體液中的含量發(fā)生變化。為了進一步研究AP患者循環(huán)血miRNAs表達水平變化情況,尋找早期診斷AP病情嚴重程度的miRNAs標志物,以及明確miRNAs在AP發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用和具體分子機制,本課題運用動物實驗、細胞學實驗和分子生物學等方法,對上述問題進行了研究。一、急性胰腺炎患者血漿中miRNAs的異常表達研究 目的:研究AP患者循環(huán)血miRNAs表達水平的特點以及循環(huán)血miRNAs在MAP與SAP患者之間的表達差異。方法:分別收集健康對照者、MAP患者以及SAP患者的血液樣本。抽提患者血漿總RNA,并對RNA樣本質量進行檢測。以芯片法檢測患者循環(huán)血血漿中miRNAs表達的差異。結果:AP患者的循環(huán)血血漿中的miRNAs表達水平有著較明顯的改變。AP患者與正常對照者相比較,循環(huán)血血漿中有75種miRNAs含量有明顯改變(改變2倍以上,P0.05者),其中55種miRNAs表達升高,20種miRNAs表達降低。在AP患者中,MAP患者的循環(huán)血血漿miRNAs表達水平改變較為輕微,MAP患者與健康對照相比,其循環(huán)血血漿中共有19種miRNAs發(fā)生顯著變化,其中有14種miRNAs表達升高,5種miRNAs表達下降。而SAP患者血漿miRNAs變化則較為顯著,與健康對照者相比較,血漿中共有177種miRNAs發(fā)生明顯變化,其中135種miRNAs顯著升高,而42種miRNAs顯著下降。此外,SAP患者與MAP患者相比較,其循環(huán)血血漿中的miRNAs表達也具有明顯的差異,SAP患者與MAP患者相比較,其血漿中80種miRNAs含量有明顯改變,其中57種miRNAs表達升高,23中miRNAs表達降低。結論:AP患者與健康對照相比,循環(huán)血血漿中miRNAs的表達水平有著顯著的差異,提示miRNAs在AP的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。SAP患者循環(huán)血血漿中miRNAs的表達與MAP患者具有明顯的差異。為本研究為未來研究miRNAs在AP中的調(diào)節(jié)作用以及尋找診斷SAP的miRNAs生物學標志物奠定了研究基礎。二、循環(huán)血miRNAs標志物早期診斷SAP研究 目的:研究SAP與MAP和MSAP患者之間循環(huán)血血漿miRNAs表達差異,尋找早期診斷SAP的miRNAs標志物。方法:采用前瞻性的方法,在AP患者入院時采集患者血液樣本。抽取AP患者循環(huán)血血漿RNA,采用RT-q PCR的方法,檢測患者循環(huán)血血漿中特定miRNAs的表達水平,并分析各組間的差異。采用ROC曲線的方法,分析循環(huán)血血漿miRNAs標志物診斷SAP的特異性和敏感性。結果:在本研究檢測的血漿miRNAs之中,有12種miRNAs(miR-1208、miR-3127-5p、miR-3180-3p、miR-3187-3p、miR-4265、miR-4294、miR-4513、miR-4725-3p、miR-4776-5p、miR-516a-3p、miR-6083和miR-770-5p)在SAP患者的血漿中表達水平顯著升高,與MAP組和MSAP組患者相比,其升高均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。ROC曲線分析顯示12種miRNAs均可以用作AP病情嚴重程度分級的指標,其中miR-1208(AUC 0.88,敏感性80.95%,特異性84.88%,P0.001)、miR-3180-3p(AUC0.914,敏感性80.95%,特異性88.37%,P0.001)、miR-4265(AUC 0.881,敏感性80.95%,特異性86.05%,P0.001)和miR-4776-5p(AUC 0.896,敏感性90.48%,特異性76.74%,P0.001)用于AP病情嚴重分級效果較好,具有較高的敏感性和特異性。結論:SAP患者與MAP和MSAP患者相比,循環(huán)血血漿中的多種miRNAs表達水平具有顯著差異。循環(huán)血血漿miRNAs可以作為診斷SAP的標志物,具有較高的特異性和敏感性。三、miRNA-494在AP中的表達及其調(diào)節(jié)胰腺腺泡細胞凋亡的機制研究目的:研究在AP條件下胰腺miR-494表達水平的改變,以及其對胰腺腺泡細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及具體分子機制。方法:構建雨蛙素誘導的AP小鼠模型和AR42J細胞模型,采用病理學檢查、檢測血清及細胞培養(yǎng)上清液中淀粉酶、TNF-α、IL-1和IL-6等AP標志物的方法驗證造模情況。采用RT-q PCR的方法,檢測AP條件下胰腺miR-494表達水平的改變。采用流式細胞法分析miR-494對胰腺腺泡細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。采用Western blot的方法,檢測miR-494可能的下游凋亡相關蛋白改變情況,尋找miR-494調(diào)節(jié)胰腺腺泡細胞凋亡的具體分子機制。結果:AP組小鼠胰腺組織損傷嚴重,出現(xiàn)典型的AP表現(xiàn)。淀粉酶及炎性分子在AP組明顯升高,造模成功。miR-494在AP條件下表達顯著升高。miR-494可以抑制胰腺腺泡細胞凋亡。Western blot顯示,miR-494對促凋亡蛋白ROCK1、PTEN和CAMKIIδ具有抑制作用。結論:在AP條件下,胰腺miR-494的表達上調(diào)。miR-494通過靶向抑制ROCK1、PTEN和CAMKIIδ等促凋亡蛋白的表達,抑制胰腺腺泡細胞的凋亡。四、TGF-β/Smad3通路轉錄調(diào)控miR-494機制研究目的:研究在AP條件下,引起胰腺miR-494表達水平升高的具體分子機制。方法:通過Western blot的方法檢測p Smad3的表達情況,觀察AP條件下TGF-β信號通路的活性改變。觀察TGF-β對胰腺腺泡細胞miR-494表達水平的調(diào)節(jié)作用。采用啟動子序列分析的方法,尋找miR-494啟動子序列的Smad蛋白結合位點。通過構建包含miR-494啟動子序列的熒光素酶報告基因質粒,采用雙熒光素酶報告基因檢測的方法研究TGF-β對miR-494啟動子活性的調(diào)節(jié)作用。結果:在AP條件下,p Smad3的表達水平升高,胰腺的TGF-β信號通路激活。TGF-β可以上調(diào)胰腺腺泡細胞中miR-494的表達水平。miR-494的啟動子序列中含有多個Smad3的結合位點。TGF-β可以上調(diào)miR-494啟動子的活性。結論:在AP條件下,TGF-β信號通路的活性升高,TGF-β/Smad3通過上調(diào)miR-494啟動子的活性,調(diào)節(jié)miR-494的表達水平。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R576

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 秦濤;付強;潘延鳳;劉傳江;王玉柱;胡明星;唐強;張宏偉;;Expressions of miR-22 and miR-135a in Acute Pancreatitis[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年02期

2 樓愷嫻,龔自華,袁耀宗,涂水平,翟祖康,徐家裕;大黃素對急性胰腺炎胰腺組織TGF_(β1)表達的影響[J];中國中西醫(yī)結合雜志;2001年06期

，

本文編號：2274747