【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是胰腺的急性炎癥性病變,可以由高脂血癥、酗酒和膽系疾病等多種病因?qū)е�。AP既可以表現(xiàn)為一般的輕度水腫型炎癥,也可以表現(xiàn)為具有致命性的重癥炎癥。根據(jù)AP患者的局部或全身并發(fā)癥以及是否存在一過性或持續(xù)性臟器衰竭情況,可以將AP患者分為輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)、中度重癥急性胰腺炎(moderate severe acute pancreatitis,MSAP)和重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。AP患者的預(yù)后差異很大,MAP的預(yù)后較好,病死率接近0%,而SAP病情嚴(yán)重,預(yù)后較差。SAP的特征是患者伴有持續(xù)性臟器衰竭,即臟器衰竭時(shí)間超過48h。在所有AP患者中10%~20%可能出現(xiàn)持續(xù)性臟器衰竭,患者死亡率可以達(dá)到30%~50%。miRNAs是一類高度保守的短鏈非編碼RNA,其長度約為17-25個(gè)核苷酸,可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。miRNAs通過堿基互補(bǔ)配對與編碼蛋白的m RNA的3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)相結(jié)合,負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)水平。據(jù)估計(jì)miRNAs對哺乳動(dòng)物超過30%的蛋白編碼基因具有活性調(diào)控作用。由于miRNAs在基因調(diào)控中具有重要的作用,其表達(dá)水平在眾多生理、病理?xiàng)l件下均有顯著改變。在多種疾病的發(fā)生過程中,miRNAs在病變組織或循環(huán)血等體液中的含量發(fā)生變化。為了進(jìn)一步研究AP患者循環(huán)血miRNAs表達(dá)水平變化情況,尋找早期診斷AP病情嚴(yán)重程度的miRNAs標(biāo)志物,以及明確miRNAs在AP發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用和具體分子機(jī)制,本課題運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)等方法,對上述問題進(jìn)行了研究。一、急性胰腺炎患者血漿中miRNAs的異常表達(dá)研究 目的:研究AP患者循環(huán)血miRNAs表達(dá)水平的特點(diǎn)以及循環(huán)血miRNAs在MAP與SAP患者之間的表達(dá)差異。方法:分別收集健康對照者、MAP患者以及SAP患者的血液樣本。抽提患者血漿總RNA,并對RNA樣本質(zhì)量進(jìn)行檢測。以芯片法檢測患者循環(huán)血血漿中miRNAs表達(dá)的差異。結(jié)果:AP患者的循環(huán)血血漿中的miRNAs表達(dá)水平有著較明顯的改變。AP患者與正常對照者相比較,循環(huán)血血漿中有75種miRNAs含量有明顯改變(改變2倍以上,P0.05者),其中55種miRNAs表達(dá)升高,20種miRNAs表達(dá)降低。在AP患者中,MAP患者的循環(huán)血血漿miRNAs表達(dá)水平改變較為輕微,MAP患者與健康對照相比,其循環(huán)血血漿中共有19種miRNAs發(fā)生顯著變化,其中有14種miRNAs表達(dá)升高,5種miRNAs表達(dá)下降。而SAP患者血漿miRNAs變化則較為顯著,與健康對照者相比較,血漿中共有177種miRNAs發(fā)生明顯變化,其中135種miRNAs顯著升高,而42種miRNAs顯著下降。此外,SAP患者與MAP患者相比較,其循環(huán)血血漿中的miRNAs表達(dá)也具有明顯的差異,SAP患者與MAP患者相比較,其血漿中80種miRNAs含量有明顯改變,其中57種miRNAs表達(dá)升高,23中miRNAs表達(dá)降低。結(jié)論:AP患者與健康對照相比,循環(huán)血血漿中miRNAs的表達(dá)水平有著顯著的差異,提示miRNAs在AP的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。SAP患者循環(huán)血血漿中miRNAs的表達(dá)與MAP患者具有明顯的差異。為本研究為未來研究miRNAs在AP中的調(diào)節(jié)作用以及尋找診斷SAP的miRNAs生物學(xué)標(biāo)志物奠定了研究基礎(chǔ)。二、循環(huán)血miRNAs標(biāo)志物早期診斷SAP研究 目的:研究SAP與MAP和MSAP患者之間循環(huán)血血漿miRNAs表達(dá)差異,尋找早期診斷SAP的miRNAs標(biāo)志物。方法:采用前瞻性的方法,在AP患者入院時(shí)采集患者血液樣本。抽取AP患者循環(huán)血血漿RNA,采用RT-q PCR的方法,檢測患者循環(huán)血血漿中特定miRNAs的表達(dá)水平,并分析各組間的差異。采用ROC曲線的方法,分析循環(huán)血血漿miRNAs標(biāo)志物診斷SAP的特異性和敏感性。結(jié)果:在本研究檢測的血漿miRNAs之中,有12種miRNAs(miR-1208、miR-3127-5p、miR-3180-3p、miR-3187-3p、miR-4265、miR-4294、miR-4513、miR-4725-3p、miR-4776-5p、miR-516a-3p、miR-6083和miR-770-5p)在SAP患者的血漿中表達(dá)水平顯著升高,與MAP組和MSAP組患者相比,其升高均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。ROC曲線分析顯示12種miRNAs均可以用作AP病情嚴(yán)重程度分級的指標(biāo),其中miR-1208(AUC 0.88,敏感性80.95%,特異性84.88%,P0.001)、miR-3180-3p(AUC0.914,敏感性80.95%,特異性88.37%,P0.001)、miR-4265(AUC 0.881,敏感性80.95%,特異性86.05%,P0.001)和miR-4776-5p(AUC 0.896,敏感性90.48%,特異性76.74%,P0.001)用于AP病情嚴(yán)重分級效果較好,具有較高的敏感性和特異性。結(jié)論:SAP患者與MAP和MSAP患者相比,循環(huán)血血漿中的多種miRNAs表達(dá)水平具有顯著差異。循環(huán)血血漿miRNAs可以作為診斷SAP的標(biāo)志物,具有較高的特異性和敏感性。三、miRNA-494在AP中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究目的:研究在AP條件下胰腺miR-494表達(dá)水平的改變,以及其對胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及具體分子機(jī)制。方法:構(gòu)建雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠模型和AR42J細(xì)胞模型,采用病理學(xué)檢查、檢測血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中淀粉酶、TNF-α、IL-1和IL-6等AP標(biāo)志物的方法驗(yàn)證造模情況。采用RT-q PCR的方法,檢測AP條件下胰腺miR-494表達(dá)水平的改變。采用流式細(xì)胞法分析miR-494對胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。采用Western blot的方法,檢測miR-494可能的下游凋亡相關(guān)蛋白改變情況,尋找miR-494調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制。結(jié)果:AP組小鼠胰腺組織損傷嚴(yán)重,出現(xiàn)典型的AP表現(xiàn)。淀粉酶及炎性分子在AP組明顯升高,造模成功。miR-494在AP條件下表達(dá)顯著升高。miR-494可以抑制胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。Western blot顯示,miR-494對促凋亡蛋白ROCK1、PTEN和CAMKIIδ具有抑制作用。結(jié)論:在AP條件下,胰腺miR-494的表達(dá)上調(diào)。miR-494通過靶向抑制ROCK1、PTEN和CAMKIIδ等促凋亡蛋白的表達(dá),抑制胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡。四、TGF-β/Smad3通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-494機(jī)制研究目的:研究在AP條件下,引起胰腺miR-494表達(dá)水平升高的具體分子機(jī)制。方法:通過Western blot的方法檢測p Smad3的表達(dá)情況,觀察AP條件下TGF-β信號通路的活性改變。觀察TGF-β對胰腺腺泡細(xì)胞miR-494表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用。采用啟動(dòng)子序列分析的方法,尋找miR-494啟動(dòng)子序列的Smad蛋白結(jié)合位點(diǎn)。通過構(gòu)建包含miR-494啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測的方法研究TGF-β對miR-494啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果:在AP條件下,p Smad3的表達(dá)水平升高,胰腺的TGF-β信號通路激活。TGF-β可以上調(diào)胰腺腺泡細(xì)胞中miR-494的表達(dá)水平。miR-494的啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)Smad3的結(jié)合位點(diǎn)。TGF-β可以上調(diào)miR-494啟動(dòng)子的活性。結(jié)論:在AP條件下,TGF-β信號通路的活性升高,TGF-β/Smad3通過上調(diào)miR-494啟動(dòng)子的活性,調(diào)節(jié)miR-494的表達(dá)水平。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R576

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2274747