【摘要】：研究背景： 肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆轉(zhuǎn)的過程,是肝臟對(duì)慢性持續(xù)性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),亦是多種病因(如病毒性肝炎,酒精性肝炎,遺傳代謝性肝炎,自身免疫性肝炎等)導(dǎo)致的慢性肝病或肝臟損傷向肝硬化方向發(fā)展的病理過程。肝纖維化發(fā)展至肝硬化后便不再逆轉(zhuǎn),肝硬化后肝功能異常使機(jī)體出現(xiàn)全身紊亂,而除進(jìn)行肝移植手術(shù)外暫無較好的治療方法。因此,在肝纖維化早期,如何逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程阻斷其發(fā)展成為肝硬化,具有相當(dāng)?shù)呐R床應(yīng)用價(jià)值。但由于其發(fā)生機(jī)制及影響因素的復(fù)雜性目前仍然未有明確的有效方法。因此,肝纖維化治療的研究中對(duì)于肝纖維化機(jī)制的研究已成為該領(lǐng)域的重點(diǎn)及難點(diǎn)。 腎素血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),它可作用于全身多個(gè)器官。心、腎、肺、胰腺和肝臟都存在局部或器官內(nèi)的RAS,并且參與了組織器官的纖維化和(或)結(jié)構(gòu)重塑過程。在肝組織細(xì)胞中同樣存在局部RAS,其中血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是重要的成分之一,AngⅡ由血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)的作用下水解產(chǎn)生,并且通過血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type1receptor, AT1R)發(fā)揮作用。在肝臟局部組織中,AngⅡ能發(fā)出胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),提高胞漿內(nèi)Ca2+的濃度從而刺激肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的增殖與活化,促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展。通過對(duì)AngⅡ介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行抑制,可以減少組織損害引起的纖維化及增殖�，F(xiàn)已證實(shí)血管緊張素Ⅱ1型受體阻滯劑(angiotensin II type1receptor blockers, ARBs)以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)在抑制AngⅡ信號(hào)通路,抗纖維化及抗增殖方面有一定作用。另有研究證明,血管緊張素(1-7)[angiotensin (1-7), Ang(1-7)]也有同樣的反向調(diào)節(jié)AngⅡ的作用。Ang(1-7)主要是由AngⅡ在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme2, ACE2)的作用下水解產(chǎn)生,其通過與Mas受體結(jié)合來觸發(fā)新的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮其自身效應(yīng),拮抗AngⅡ,此外,Ang(1-7)還可以競爭性地與AngⅡ的受體AT1R結(jié)合來拮抗AngⅡ的活性,具有舒張血管,降低血壓,利尿,抑制成纖維細(xì)胞增殖等作用。由此學(xué)者們提出,ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸可能是局部RAS發(fā)揮其自身內(nèi)部調(diào)節(jié)功能的另一個(gè)效應(yīng)軸,即在局部RAS中存在相互聯(lián)系相互制約的兩個(gè)作用軸,即ACE-AngⅡ-AT1受體軸和ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸。 近年來,有研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ的受體1的結(jié)合蛋白(angiotensin II type1receptor associated protein, ATRAP)在高血壓心臟病的發(fā)病過程中可以拮抗AT1R的作用,即對(duì)ACE-AngⅡ-AT1受體軸起反向調(diào)節(jié)作用。ATRAP通過與AT1R羧基末端特異性結(jié)合,介導(dǎo)AT1R的內(nèi)化、減敏及磷酸化來拮抗AT1R信號(hào)通路的傳導(dǎo),從而達(dá)到其反向調(diào)節(jié)ACE-AngⅡ-AT1受體軸的作用。此觀點(diǎn)在腎臟及心臟組織或細(xì)胞的研究中也得到一些研究證實(shí),然而在肝臟纖維化進(jìn)程中,肝星形細(xì)胞是否同樣存在ATRAP的表達(dá)及其對(duì)AngⅡ/AT1R信號(hào)的抑制作用,ATRAP在局部RAS中如何發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,目前尚未見研究報(bào)道。因此,在本研究中,我們利用大鼠永生化肝星形細(xì)胞株(HSC-T6)作為研究對(duì)象,利用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)正常狀態(tài)下生長的HSC-T6細(xì)胞中是否存在ATRAP的表達(dá),并通過改變HSC-T6局部RAS的成分,破壞其平衡,即分別加入AngⅡ及Ang(1-7)對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行刺激,探討ATRAP與局部腎素血管緊張素系統(tǒng)中ACE-AngⅡ-AT1受體軸、ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸之間可能存在的關(guān)系,即ATRAP在局部RAS中的調(diào)節(jié)作用。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、大鼠肝星形細(xì)胞(HSC-T6)的培養(yǎng)及處理前準(zhǔn)備：在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的C02條件下,將HSC-T6培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,每日觀察其細(xì)胞形態(tài)和生長狀況,每周傳代2次。進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)前,將細(xì)胞傳代至6孔板中,以約4×105cells/mL的細(xì)胞密度,集中1mL細(xì)胞,其后補(bǔ)加1mL培養(yǎng)基,輕搖使細(xì)胞均勻分散,其后至于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,更換培養(yǎng)基為含有1μmol/L各實(shí)驗(yàn)藥物的培養(yǎng)基,對(duì)照組仍為完全培養(yǎng)基,處理后繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2、用濃度為1μmol/L的藥物AngⅡ?qū)SC-T6進(jìn)行單次小劑量刺激處理,刺激后繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在刺激后2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)以及36小時(shí)等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)HSC-T6在以上各時(shí)間點(diǎn)目的基因ATRAP、血管緊張素Ⅱ受體1(AT1R)、Mas受體以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)等mRNA的表達(dá)水平,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)上述各時(shí)間點(diǎn),各目的基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此為AngⅡ?qū)嶒?yàn)組。 3、用濃度為1μmol/L的藥物Ang(1-7)對(duì)HSC-T6進(jìn)行單次小劑量刺激處理,刺激后繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在刺激后2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)以及36小時(shí)等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)HSC-T6在以上各時(shí)間點(diǎn)目的基因ATRAP.血管緊張素Ⅱ受體1(AT1R)、Mas受體以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)等mRNA的表達(dá)水平,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)上述各時(shí)間點(diǎn),各目的基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此為Ang(1-7)實(shí)驗(yàn)組。 4、未作任何藥物刺激處理的肝星形細(xì)胞作為陰性對(duì)照組,在以上相同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,qRT-PCR及Western blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn),各目的基因的mRNA及蛋白質(zhì)水平。 5、采用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析同一處理組中某一目的基因mRNA或蛋白的表達(dá)量是否隨時(shí)間的變化而存在差異,兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的方法用于分析在同一時(shí)間點(diǎn)某一目的基因在藥物刺激組與對(duì)照組表達(dá)是否存在差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、目的基因在HSC-T6中表達(dá)的基線水平 在對(duì)照組中,mRNA水平及蛋白水平皆可檢測(cè)到ATRAP, AT1受體,Mas受體及ACE2四個(gè)目的基因在HSC-T6中均有表達(dá)。ATRAP, AT1受體及Mas受體的表達(dá)量相對(duì)維持在比較穩(wěn)定的水平,2小時(shí),6小時(shí),12小時(shí),18小時(shí),24小時(shí)及36小時(shí)均未見明顯改變(P0.05)。然而ACE2的表達(dá)量隨觀察時(shí)間的變化有所起伏(F=87.56,P=0.000)。將基線2小時(shí)ACE2基因mRNA水平表達(dá)量定為1,那么6小時(shí),12小時(shí),18小時(shí),24小時(shí)及36小時(shí)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量分別為：1.52,1.56,1.93,2.18,1.76。Western blot結(jié)果顯示與mRNA水平較為一致,各時(shí)間點(diǎn)蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1,1.13,1.06,0.94,2,1.74。 2、單次AngⅡ刺激后目的基因在HSC-T6中表達(dá)的改變 在單次小劑量的AngⅡ刺激后,對(duì)于mRNA結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),單因素方差分析結(jié)果提示,ATRAP及ACE2的表達(dá)水平隨培養(yǎng)時(shí)間變化而有所改變(F=47.49,P=0.000和F=-262.05,P=0.000)。與基線水平相比較,ATRAP自刺激后12小時(shí)起,其表達(dá)量維持在較高水平(12小時(shí)點(diǎn)P=0.003,18,24及36小時(shí)點(diǎn)P=0.000)。對(duì)于ACE2基因,在刺激后6小時(shí)點(diǎn)出現(xiàn)了一個(gè)明顯的高表達(dá)(P=0.01),之后在12小時(shí)又回落至基線水平(P=0.831),之后一直維持在略低于基線的表達(dá)量(各點(diǎn)均是P=0.000)。處理之后的HSC-T6中AT1受體及Mas受體均無明顯改變,與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)分別相比較,也未見明顯差異(P0.05)。Western blot結(jié)果大致與mRNA結(jié)果一致,或部分較晚出現(xiàn)與mRNA相同的變化趨勢(shì),更驗(yàn)證了mRNA的表達(dá)趨勢(shì)變化。 3、單次Ang(1-7)刺激后目的基因在HSC-T6中表達(dá)的改變 在單次小劑量Ang(1-7)刺激之后,對(duì)于mRNA結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),單因素方差分析結(jié)果提示ATRAP及ACE2的表達(dá)量都隨時(shí)間改變有所不同(F=8.447,P=0.01和F=132.39,P=0.000)。ATRAP自6小時(shí)起到觀察終點(diǎn),都有較高的表達(dá)量(各點(diǎn)分別為P=0.029,0.000,0.003,0.03,0.002),且在12小時(shí)點(diǎn)表達(dá)量最高。它的mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本同于蛋白表達(dá)。而ACE2基因表達(dá)受抑制,自6小時(shí)起(P=0.008),其表達(dá)量與同時(shí)刻對(duì)照組表達(dá)量比較,皆低于基線水平,在18小時(shí)達(dá)最低(P=0.000)。ACE2蛋白的表達(dá)抑制出現(xiàn)于刺激后24小時(shí),較晚于mRNA的變化。同樣的,單次小劑量的Ang(1-7)刺激并未引起AT1受體及Mas受體表達(dá)改變。 結(jié)論： 1、在對(duì)照處理組(即陰性對(duì)照)中HSC-T6有AT1受體、ATRAP、Mas受體以及ACE2的表達(dá)。除ACE2隨觀察時(shí)間的變化表達(dá)量略有改變,其余目的基因表達(dá)量都處于較低的水平且保持相對(duì)穩(wěn)定。肝組織局部存在RAS成分表達(dá)已有研究報(bào)道,但對(duì)于ATRAP基因在肝組織細(xì)胞的表達(dá)尚未見報(bào)道,本研究首次驗(yàn)證了大鼠肝星形細(xì)胞(HSC-T6)中存在ATRAP基因的表達(dá)。 2、大鼠肝星形細(xì)胞(HSC-T6)中RAS的各成分之間是相互聯(lián)系相互制約的,ACE-AngⅡ-AT1受體軸與ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸之間的平衡關(guān)系確切存在。當(dāng)小劑量AngⅡ刺激HSC-T6后,AngⅡ通過AT1受體介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo),促進(jìn)細(xì)胞增殖,與此同時(shí),局部RAS開始啟動(dòng)自身平衡調(diào)節(jié)作用,此信號(hào)通路信號(hào)的增強(qiáng)也激活了負(fù)性調(diào)節(jié)因子的作用,ATRAP及ACE2活化上調(diào)。對(duì)于ATRAP,其可能是通過介導(dǎo)AT1受體內(nèi)化、脫敏和磷酸化等而發(fā)揮作用,而并不抑制AT1受體的表達(dá)量。 3、Ang(1-7)刺激HSC-T6直接效應(yīng)是引起ACE2基因與蛋白的表達(dá)量下調(diào),而Mas受體則無明顯改變。另外Ang(1-7)濃度的增加可能通過細(xì)胞局部RAS自身平衡調(diào)節(jié)機(jī)制引起ACE-AngⅡ-AT1受體軸的上調(diào),而反應(yīng)性增高AngⅡ從而導(dǎo)致了ATRAP表達(dá)水平的上調(diào)。 4、ATRAP基因表達(dá)的改變可能對(duì)AngⅡ的上升比對(duì)于Ang(1-7)更為敏感,即ATRAP上調(diào)表達(dá)來拮抗ACE-AngⅡ-AT1受體軸,從而發(fā)揮其在局部RAS中調(diào)節(jié)平衡的作用。 5、ATRAP在HSC-T6中存在表達(dá),并參與局部RAS的自身調(diào)節(jié),有拮抗局部AngⅡ的作用。單次低劑量的AngⅡ或Ang(1-7)的刺激都會(huì)引起HSC-T6中ATRAP的表達(dá)增多。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 王寶恩;肝星狀細(xì)胞與肝纖維化[J];中華肝臟病雜志;2000年04期

2 申鳳俊,唐淑珍,王平,陰峧宏,李琴,賈繼東,王寶恩;纈沙坦對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖及膠原合成的影響[J];中華肝臟病雜志;2004年09期

3 申鳳俊,朱躍科,李琴,賈繼東,王寶恩;肝纖維化形成過程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的變化[J];肝臟;2003年04期

4 Regina Maria Pereira;Robson Augusto Souza dos Santos;Filipi Leles da Costa Dias;Mauro Martins Teixeira;Ana Cristina Simoes e Silva;;Renin-angiotensin system in the pathogenesis of liver fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2009年21期

，

本文編號(hào)：2266544