【摘要】：目的:通過研究重癥急性胰腺炎動物模型中自噬的表達及變化情況,探討自噬與重癥急性胰腺炎的關系,為臨床上重癥急性胰腺炎的治療提供潛在靶點。方法:將48只健康清潔級雄性SD大鼠,隨機分配為兩組,即對照組(SO)和急性壞死性胰腺炎組(ANP),每組24只大鼠。ANP組采用經(jīng)胰膽管逆行注射5%�；悄懰徕c方法制造急性壞死性胰腺炎動物模型。對照組僅翻動胰腺組織,不注射藥物。每組大鼠按照3h、6h和12h三個時相點再分為3個亞組,每亞組8只大鼠,分別于手術造模后不同時間點收集血清及胰腺組織,血清用于淀粉酶的檢測;胰腺組織一部分用4%甲醛固定,行HE染色和免疫組化測定LC3B、Beclin1及P62的表達;另一部分用2.5%戊二醛固定行電鏡觀察。結果:1、造模情況及胰腺組織HE染色病理學評分:(1)大體觀察:SO組胰腺無結構異常,周圍網(wǎng)膜清晰,未見腹水形成;ANP 3h亞組可見胰腺組織腫脹;6h亞組胰腺組織腫脹明顯加重,可見胰腺組織有散在出血點,有少量腹水出現(xiàn);12h亞組胰腺組織及周圍網(wǎng)膜有片狀出血性壞死,可見中等量血性腹水。(2)胰腺組織病理學評分:根據(jù)Schmidt評分標準:(1)ANP組與SO組對應時間點各亞組比較病理學評分具有顯著性差異(P0.05);(2)ANP 12h亞組的病理學評分顯著增加,且胰腺組織損傷程度亦增加,與ANP 3h亞組相比具有顯著性差異(P0.05)。2、大鼠血清淀粉酶測定:(1)SO組的各亞組血清淀粉酶值均無明顯差異(P0.05);(2)ANP組與SO組相比,對應時間點各亞組之間血清淀粉酶值顯著升高,且有顯著性差異(P0.05)。3、透射電鏡觀察胰腺組織:(1)SO組電鏡下胰腺細胞核膜結構完整,胞質中細胞器的結構基本正常,少見自噬小體;(2)ANP 3h亞組可見有呈“C”形雙層膜結構的自噬小體;6h亞組見線粒體明顯腫脹,自噬小體增多,部分自噬小體與溶酶體融合;12亞組可見自噬小體及自噬溶酶體進一步增多,并存在溶酶體內(nèi)降解內(nèi)容物現(xiàn)象;4、免疫組化方法檢測胰腺組織LC3B、Beclin1及P62:(1)SO組中LC3B有少量表達,各亞組間評分無明顯差異(P0.05);ANP組相較SO組,各亞組LC3B評分均有明顯增加(P0.05);ANP組中隨造模時間的延長,LC3B陽性細胞表達增多,評分增加,且各亞組間評分具有明顯差異(P0.05);(2)SO組Beclin1呈低表達,且各亞組間評分無明顯差別(P0.05);與SO組比較,ANP組中各亞組Beclin1表達顯著增加(P0.05);其中,ANP 6h亞組和12h亞組細胞胞漿著色明顯變深,陽性細胞表達明顯增加,與3h亞組比較均具有顯著性差異(P0.05);(3)SO組P62有少量表達,各亞組間評分無明顯差異(P0.05);與SO組比較,ANP組各亞組P62表達均有明顯增高,具有顯著性差異(P0.05);ANP組中各亞組間評分無明顯差異(P0.05)。結論:1、采用5%牛磺膽酸鈉經(jīng)胰膽管逆行注射法,成功建立了急性壞死性胰腺炎(ANP)的動物模型;2、與SO組相比,ANP組中自噬的表達顯著增加,并且自噬的表達隨胰腺病理損傷程度的加重而增加;3、與SO組相比,ANP組中P62的表達顯著增加,表明自噬的降解功能明顯下降;4、自噬的功能受損可能參與到急性胰腺炎腺泡細胞損傷的過程中。
[Abstract]:Objective: To study the expression and changes of autophagy in the animal model of severe acute pancreatitis (SAP), and to explore the relationship between autophagy and severe acute pancreatitis (SAP) and provide potential targets for the treatment of severe acute pancreatitis. Methods: 48 healthy and clean male SD rats were randomly assigned to two groups, that is, the control group (SO) and the acute necrotizing pancreatitis. The.ANP group of 24 rats in each group was used to produce acute necrotizing pancreatitis by retrograde injection of 5% sodium taurocholate to the group of 24 rats. The control group only turned the pancreas tissue and did not injecting drugs. The rats in each group were divided into 3 subgroups according to the three phase points of 3H, 6H and 12h, and 8 rats in each subgroup were different at the same time after the operation. The serum and pancreatic tissue were collected at the interval, and the serum was used for the detection of amylase. The pancreas tissue was fixed with 4% formaldehyde, HE staining and immunohistochemistry were used to determine the expression of LC3B, Beclin1 and P62. The other part was fixed with 2.5% glutaraldehyde for electron microscopy. Results: 1, the modeling situation and the HE staining of pancreatic gland pathology score: (1) gross observation: SO group pancreas No abnormal structure of the glands, clear surrounding omentum, no ascites formation, ANP 3H subgroup can see the swelling of the pancreas tissue, 6h subgroup of pancreatic tissue swelling obviously aggravated, the pancreatic tissue has scattered bleeding point, a small amount of ascites appear, the pancreas tissue and peripheral omentum in the 12h subgroup are hemorrhagic necrotic, and the pancreatic tissue disease is visible. (2) pancreatic tissue disease Science score: according to the Schmidt score standard: (1) the comparative pathological score of each group in group ANP and group SO had significant difference (P0.05); (2) the pathological score of the ANP 12h subgroup increased significantly, and the degree of pancreatic tissue injury increased, and the ratio of the ANP 3H subgroup was significantly different (P0.05).2, the serum amylase determination in the rat: (1) SO. There was no significant difference in serum amylase between the subgroups of the group (P0.05). (2) compared with the SO group, the serum amylase value of the ANP group was significantly higher than that of the SO group, and there was a significant difference (P0.05).3. The transmission electron microscope was used to observe the pancreatic tissue: (1) the nuclear membrane structure of the pancreatic cells in the SO group was intact and the structure of the organelle in the cytoplasm was basically normal. See autophagic corpuscle; (2) ANP 3H subgroup can see autophagic body with "C" bilayer structure; 6h subgroup can see obvious mitochondria swelling, autophagosome increasing, partial autophagosome and lysosome fusion; the 12 subgroup can see autophagosome and autophagosome further increase, coexist in dissolve enzyme to degrade content phenomenon; 4, immunohistochemical method inspection There was a small amount of expression of LC3B in group LC3B, Beclin1 and P62: (1) SO group, and there was no significant difference between the sub groups (P0.05). The LC3B scores in each subgroup were significantly increased in the ANP group than in the SO group (P0.05), and the expression of the LC3B positive cells increased with the prolongation of the model time in the ANP group, and the score of the subgroups increased, and the scores of each subgroup were significantly different (2) Group Beclin1 showed low expression and no significant difference in scores between subgroups (P0.05). Compared with group SO, Beclin1 expression in each group of group ANP increased significantly (P0.05); in ANP 6h subgroup and 12h subgroup, the cytoplasmic staining was obviously deeper, the expression of positive cells increased obviously, and there was significant difference (P0.05) compared with the 3H subgroup (P0.05); (3) SO group had a small number of tables. There was no significant difference in scores between subgroups of each group (P0.05). Compared with group SO, the expression of P62 in each subgroup of group ANP was significantly higher (P0.05), and there was no significant difference between the sub groups in group ANP (P0.05). Conclusion: 1, the animal model of acute necrotizing pancreatitis (ANP) was successfully established by using 5% sodium taurocholate through the retrograde injection of pancreatic bile duct. 2, compared with group SO, the expression of autophagy increased significantly in group ANP, and the expression of autophagy increased with the severity of pancreatic pathological damage; 3, compared with group SO, the expression of P62 increased significantly in group ANP, indicating that the degradation function of autophagy decreased obviously; 4, the impairment of autophagy may be involved in the process of acinar cell injury in acute pancreatitis.
【學位授予單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R576

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本文編號：2173660