本文關(guān)鍵詞：HBV感染慢性化進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象及其相關(guān)發(fā)生機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《復(fù)旦大學(xué)》 2014年

HBV感染慢性化進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象及其相關(guān)發(fā)生機制

王福萍  

【摘要】：背景HBV感染慢性化進(jìn)程中,CD4+T細(xì)胞發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用,并因其亞群多樣性可對肝纖維化進(jìn)程產(chǎn)生不同的影響。前期研究中發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者體內(nèi),Treg/Th17比率隨著肝損傷和肝纖維化程度加深而降低。而T淋巴細(xì)胞本身也存在一個被調(diào)節(jié)的過程,T淋巴細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡是免疫調(diào)節(jié)的主要途徑,包括細(xì)胞凋亡(apoptosis)與自噬(autophagy)等。其中自噬是胞內(nèi)雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。有研究認(rèn)為,T淋巴細(xì)胞及其亞群通過自噬來達(dá)到免疫穩(wěn)態(tài)。近年來,實質(zhì)細(xì)胞的自噬在病毒感染、腫瘤疾病進(jìn)展以及藥物抵抗等方面的研究己經(jīng)取得一定程度的進(jìn)展。而新近報道,在HIV感染中發(fā)現(xiàn)存在CD4+T細(xì)胞的自噬現(xiàn)象,那么在HBV感染慢性化進(jìn)程中是否存在CD4+T細(xì)胞自噬功能的改變、改變受肝臟微環(huán)境何種因素影響及相關(guān)的信號通路尚不明確。方法1.HBV感染慢性化進(jìn)程中的CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象觀察分離攜帶者、慢性乙型肝炎(CHB)及乙肝后肝硬化(LC)患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC),流式細(xì)胞術(shù)分選純化患者外周血CD4+T細(xì)胞。采用電鏡觀察CD4+T細(xì)胞自噬過程中的包裹胞內(nèi)容物的雙層膜結(jié)構(gòu),在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平明確疾病進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬功能的改變；采用細(xì)胞免疫熒光法直觀檢測CD4+T細(xì)胞中LC3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3)的定位及表達(dá)。采用多色流式細(xì)胞術(shù)(指標(biāo)包括CD4、LC3B),分析外周血CD4+T細(xì)胞自噬活動的表達(dá)情況,以及Western blot分析疾病進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬特異性蛋白LC3II/LC3I相關(guān)蛋白(Atg5、Atg7和Beclin-1)以及降解蛋白p62變化情況。2.CD4+T細(xì)胞自噬活動影響因素的體外研究ELISA檢測慢性乙型肝炎患者體內(nèi)血清HMGB1表達(dá),并對HMGB1與外周血CD4+T細(xì)胞自噬做相關(guān)性分析；收集不同分級分期的慢性乙型肝炎患者肝穿刺標(biāo)本,采用免疫組化法分析肝臟HMGB1表達(dá)：免疫熒光法檢測局部CD4+T細(xì)胞的自噬特異性蛋白表達(dá),從組織學(xué)水平證實肝組織局部CD4+T細(xì)胞的自噬現(xiàn)象。利用HBcAg、r-HMGB1刺激CHB組(病理分期S2-3及S4)患者外周血分離出的CD4+T細(xì)胞,多色流式細(xì)胞術(shù)檢測這兩種代表HBV感染慢性化進(jìn)程中的不同致病因素對CD4+T細(xì)胞自噬功能的影響；采用序貫刺激方法,模擬疾病進(jìn)展,進(jìn)一步觀察其對CD4+T細(xì)胞自噬活動的改變；自噬與凋亡關(guān)系錯綜復(fù)雜,為了更純粹的分析細(xì)胞自噬的相關(guān)影響因素,我們利用AnnexinV-PI染色分析細(xì)胞凋亡情況。3. HMGB1影響CD4+T細(xì)胞自噬功能的信號通路研究HMGB1刺激CD4+T細(xì)胞前后,流式細(xì)胞術(shù)檢測HMGB1受體的表達(dá)量(指標(biāo)包括TLR2、TLR4、RAGE),分析刺激物是否改變受體表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色檢測HMGB1下游的信號分子磷酸化表達(dá)情況(指標(biāo)包括p-JNK、p-AKT、 p-P38、p-ERK);加入相關(guān)受體拮抗劑或信號分子拮抗劑后,流式細(xì)胞術(shù)分析LC3B表達(dá)量以及上述信號分子的磷酸化表達(dá)情況,分析受體以及介導(dǎo)的信號通路對自噬活動的影響。結(jié)果1.HBV感染慢性化進(jìn)程中的CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象觀察多色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：外周血LC3/CD4+T比值(即CD4+T細(xì)胞中發(fā)生自噬活動的細(xì)胞比例),在HBV感染慢性化進(jìn)程中持續(xù)升高,而慢性乙型肝炎進(jìn)展至肝硬化階段,其CD4+T細(xì)胞自噬水平下降。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明,自噬特異性蛋白(LC3II/LC3I)以及相關(guān)蛋白(Atg5、Atg7和Beclin-1)表達(dá)量在疾病進(jìn)展中逐漸增加,CHB進(jìn)展至LC階段表達(dá)下調(diào),而自噬降解蛋白p62的表達(dá)與上述蛋白趨勢冶好相反,表明無論流式細(xì)胞檢測還是Western蛋白表達(dá)分析,CD4+T細(xì)胞自噬改變趨勢一致。將攜帶者、CHB和LC組,再根據(jù)病毒、炎癥、HBeAg表達(dá)、GS分期進(jìn)行亞組分析,發(fā)現(xiàn)HBV病毒載量越高,炎癥程度越高,CD4+T細(xì)胞自噬活動增強；而臨床上用來一定程度上反應(yīng)病毒復(fù)制的HBeAg指標(biāo),對細(xì)胞自噬無明顯改變。對S2-3期慢乙肝患者按照G分期的不同進(jìn)一步分組后分析發(fā)現(xiàn),外周血CD4+T細(xì)胞自噬隨著G分期的增加而增加；同樣的對G2-3期進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),隨著S分期(纖維化程度)的增加,外周血CD4+T細(xì)胞自噬表達(dá)也顯著增多,但S4期與S2-3期比較無統(tǒng)計學(xué)意義上的增加。而乙肝后肝硬化患者外周I[11CD4+T自噬現(xiàn)象,隨著Child分期評分的增加呈現(xiàn)出明顯增高趨勢。2.CD4+T細(xì)胞自噬活動影響因素的體外研究慢性乙型肝炎過程中,HMGB1水平隨S分期增加而增高,且與CD4+T細(xì)胞自噬之間存在顯著正相關(guān),提示HMGB1可能是影響CD4+T細(xì)胞自噬的一個重要因素。透射電鏡檢測和多色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：單獨給予HBcAg或IMGB1刺激,CD4+T細(xì)胞自噬表達(dá)增多；給予HBcAg和(?)HMGB1序貫刺激后,CD4+T細(xì)胞自噬表達(dá)較HBcAg單獨刺激明顯增加,但三組比較,細(xì)胞凋亡活動無明顯差異。3. HMGB1影響CD4+T細(xì)胞自噬功能的信號通路研究HBV感染慢性化進(jìn)程中呢,CD4+T細(xì)胞表面TLR2、TLR4、RAGE表達(dá)均無明顯變化,給予HMGB1刺激后,僅RAGE表達(dá)增多,提示RAGE可能參與HMGB1促進(jìn)自噬。給予RAGE中和性抗體,自噬活動相較于HMGB1刺激組減弱,磷酸化JNK/ERK表達(dá)也降低,而p38MAPK和AKT沒有明顯表達(dá)異常。結(jié)論在HBV感染慢性化進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)存在外周血CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象,表現(xiàn)為：CD4+T細(xì)胞自噬水平伴隨CHB患者血清病毒復(fù)制、肝組織炎癥及纖維化炎癥程度加重而增高；同時,LC患者肝功能Child分期的增加自噬現(xiàn)象愈為明顯。HBV病毒本身(HBcAg)和炎癥因素(HMGB1)均能有效的促進(jìn)外周血CD4+T細(xì)胞自噬增加,尤以后者更為明顯并存在疊加效應(yīng),而對細(xì)胞的凋亡無明顯影響。其中HMGB1通過RAGE介導(dǎo)的JNK/ERK信號通路軸,影響CHB患者外周血CD4+T細(xì)胞自噬功能。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.62
【目錄】：

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本文編號：216684