【摘要】：目的(1)構(gòu)建出能夠穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的L02-HBx細(xì)胞模型,以期進(jìn)一步探索HBx蛋白所具備的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性及其與原發(fā)性肝癌(HCC)發(fā)生和轉(zhuǎn)歸存在的內(nèi)在關(guān)系。(2)觀察外源性IL-6共培養(yǎng)后感染了HBx的L-02細(xì)胞生長趨勢以及細(xì)胞周期的改變情況,以期在探索IL-6能否促進(jìn)肝臟再生或改善肝硬化方面取得新進(jìn)展,也期望能為乙肝病毒感染患者提供新的細(xì)胞因子治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。方法(1) 設(shè)計(jì)以嘌呤霉素為研究目的的劑量——反應(yīng)分析實(shí)驗(yàn),摸索嘌呤霉素對于L-02的最低致死濃度。(2)通過慢病毒載體的方法建立穩(wěn)定表達(dá)HBx的L02細(xì)胞株,利用摸索得到的嘌呤霉素的最低致死濃度篩選L02-HBx細(xì)胞以獲取陽性克隆,擴(kuò)增培養(yǎng)L02-HBx細(xì)胞,并以L02-con和L02細(xì)胞作為對照,運(yùn)用普通PCR實(shí)驗(yàn)、熒光定量RT-PCR的方法以及蛋白印記Western blot技術(shù)手段檢測HBxDNA的表達(dá)、HBx mRNA的轉(zhuǎn)錄以及HBx蛋白的翻譯情況,從而確保被HBx感染的L02細(xì)胞模型最終構(gòu)建成功。(3)運(yùn)用IL-6共培養(yǎng)L02-HBx細(xì)胞,不加IL-6同步培養(yǎng)同一傳代數(shù)的L02-HBx細(xì)胞,以此作為L02-HBx細(xì)胞的陰性對照。利用高配置的倒置相差顯微鏡觀察各組當(dāng)中L02-HBx細(xì)胞在形態(tài)學(xué)方面的顯著特點(diǎn),并且運(yùn)用CCK8法檢測并且觀察對比各組中細(xì)胞的增殖情況,同時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期以及處于各個(gè)細(xì)胞周期細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例,以便對各組細(xì)胞的增殖情況和細(xì)胞周期的異同進(jìn)行客觀分析和比較。結(jié)果(1)嘌呤霉素劑量-反應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,濃度為400-1000ng/ml的嘌呤霉素將培養(yǎng)的L02細(xì)胞全部殺死,而400ng/ml以下均有細(xì)胞存活,故400ng/ml為嘌呤霉素篩選L02細(xì)胞的最低致死濃度。(2) 400ng/ml的嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染HBx的L02細(xì)胞5-7天后,可見陽性細(xì)胞的克隆,以L02-con和L02細(xì)胞作為對照組進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以后,經(jīng)普通PCR、RT-PCR技術(shù)手段檢測發(fā)現(xiàn)均分別有HBx DNA的表達(dá)、HBx mRNA的轉(zhuǎn)錄,Western blot檢測有HBx蛋白的翻譯。(3)倒置相差顯微鏡下觀察可見使用工L-6共培養(yǎng)的L02-HBx細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比生長方式獨(dú)特,以團(tuán)狀、疊層的方式生長,邊界不太清楚。CCK8檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示,經(jīng)過與IL-6共培養(yǎng)后,L02-HBx細(xì)胞生長受到抑制。與對照組相比,L02-HBx細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞所占比例顯著降低,而處于G2/M期的細(xì)胞所占比例顯著增高。結(jié)論(1)穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的L02-HBx細(xì)胞模型構(gòu)建成功,為進(jìn)一步探索HBx蛋白所具備的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性及其與原發(fā)性肝癌HCC發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)化的內(nèi)在關(guān)系奠定了深厚的基礎(chǔ)。(2)在外源性IL-6共培養(yǎng)的環(huán)境下,L02-HBx細(xì)胞的生長明顯受到抑制,細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M阻滯,細(xì)胞很可能因此發(fā)生突變變異進(jìn)而最終導(dǎo)致惡變而致癌。并且揭示了最重要的一點(diǎn),HBx可能在其所處的特定環(huán)境下發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng)。
[Abstract]:Objective (1) to construct a L02-HBx cell model with stable expression of HBx gene. The aim of this study was to explore the physicochemical and biological properties of HBx protein and its relationship with the occurrence and outcome of (HCC) in hepatocellular carcinoma. (2) to observe the growth trend of L-02 cells infected with HBx after co-culture of exogenous IL-6. Cell cycle changes, In order to explore whether IL-6 can promote liver regeneration or improve liver cirrhosis, we hope to provide new target and theoretical basis of cytokine therapy for patients with hepatitis B virus infection. Methods (1) A dose-response assay was designed to investigate the lowest lethal concentration of purine mycin against L-02. (2) L02 cell line expressing HBx stably was established by lentivirus vector method. L02-HBx cells were screened with the lowest lethal concentration of purine mycin to obtain positive clones, L02-HBx cells were amplified and cultured, and L02-con and L02 cells were used as controls. Fluorescence quantitative RT-PCR and protein imprinting Western blot technique were used to detect the transcription of HBxDNA and the translation of HBx protein, so as to ensure that the L02 cell model infected by HBx was successfully constructed. (3) L02-HBx cells were co-cultured with IL-6. L02-HBx cells of the same transmission algebra were cultured without IL-6 synchronously as negative control of L02-HBx cells. The morphological characteristics of L02-HBx cells in each group were observed by inverted phase-contrast microscope with high configuration, and the proliferation of L02-HBx cells in each group was detected and compared by CCK8 method. At the same time, flow cytometry was used to detect the cell cycle and the proportion of the cells in each cell cycle to the total number of cells, so as to analyze and compare the cell proliferation and the similarities and differences of cell cycle in each group. Results (1) the results of dose-response analysis of purine mycin showed that purine mycin at concentration of 400-1000ng/ml killed all of the cultured L02 cells, while cells survived below 400ng/ml. Therefore, 400ng/ml was the lowest lethal concentration of purine mycin to screen L02 cells. (2) after 5-7 days of 400ng/ml purine mycin screening and transfection of HBx L02 cells, the positive cells were cloned, and L02-con and L02 cells were used as control group. The expression of HBx DNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and the translation of HBx protein was detected by Western blot. (3) under inverted phase contrast microscope, the growth pattern of L02-HBx cells co-cultured with engineering L-6 was different from that of control cells. The boundary of CCK8 was not clear. The results of CCK8 further showed that the growth of L02-HBx cells was inhibited after co-culture with IL-6. Compared with the control group, the percentage of S phase cells in L02-HBx cells was significantly decreased, while that in G 2 / M phase was significantly increased. Conclusion (1) the L02-HBx cell model with stable expression of HBx gene was successfully constructed. It lays a solid foundation for further exploring the physicochemical and biological properties of HBx protein and its relationship with the development and transformation of HCC in primary liver cancer. (2) the generation of L02-HBx cells in exogenous IL-6 co-culture environment. The length is obviously suppressed, G 2 / M arrest occurs in cell cycle, which may lead to mutation and mutagenesis, which eventually leads to malignant change and carcinogenesis. It also reveals that the most important point is that HBX may play a specific biological effect in its specific environment.
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62

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本文編號：2157728