【摘要】：慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是以胰腺組織不可逆纖維化損傷為特征的進(jìn)展性炎性疾病,損傷導(dǎo)致胰腺內(nèi)、外分泌功能受損,進(jìn)而出現(xiàn)糖尿病、脂肪瀉等臨床病癥[1,2]。CP有多種病因,飲酒被廣泛認(rèn)為是急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)和CP的主要病因[1,2]。胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell,PSCs)存在于正常的胰腺組織中且一般處于靜息狀態(tài),在其胞質(zhì)內(nèi)儲(chǔ)存含維生素A豐富的脂滴;但是,當(dāng)胰腺受到炎癥或者外傷時(shí),靜息狀態(tài)的PSCs轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谐杉±w維細(xì)胞樣表型特征的活化狀態(tài),且α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)增加[3]。因此,激活的PSCs可能通過分泌一些細(xì)胞因子或趨化因子(如轉(zhuǎn)化生長因子β15),以及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成份(extracellular matrix components,ECM),如I型膠原和纖連蛋白等,在CP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮中心作用[4,5]。目前關(guān)于PSCs和CP纖維化之間關(guān)系的研究有很多,但關(guān)于IL-18、趨化因子CX3CL1與PSCs之間關(guān)系以及在CP中作用機(jī)制研究相對較少,本實(shí)驗(yàn)主要研究CP大鼠和正常大鼠PSCs活化情況和CX3CL1表達(dá)情況;以及利用不同濃度IL-18孵育PSCs,了解IL-18對PSCs的作用;并進(jìn)一步探索IL-18激活PSCs的相關(guān)信號通路,探索其發(fā)生的機(jī)制。第一部分慢性胰腺炎大鼠胰腺星狀細(xì)胞IL-18、CX3CL1、α-SMA表達(dá)情況研究目的:探索慢性胰腺炎大鼠胰腺發(fā)生纖維化后胰腺星狀細(xì)胞激活情況,以及IL-18、趨化因子CX3CL1、α-SMA表達(dá)情況。研究方法:正常Wistar雄性大鼠(體重180-200g),通過尾靜脈注射DBTC(8mg/Kg)方法造成慢性胰腺炎模型,胰腺組織通過HE染色判斷胰腺纖維化發(fā)生情況。通過消化法-梯度離心的方法提取出原代胰腺星狀細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)4天后,收集細(xì)胞,再提取細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR方法檢測IL-18、CX3CL1、α-SMA m RNA表達(dá)情況。結(jié)果:RT-PCR法檢測對照組PSCs IL-18 m RNA表達(dá)量為1.01±0.08,造模組PSCs IL-18 m RNA相對表達(dá)量為1.73±0.40,造模組PSCs IL-18 m RNA表達(dá)量高于對照組,造模組和對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對照組PSCs CX3CL1表達(dá)量為1.07±0.26,造模組PSCs CX3CL1 m RNA相對表達(dá)量為2.22±0.13,造模組PSCs CX3CL1 m RNA表達(dá)量高于對照組,造模組和對照組PSCs CX3CL1 m RNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.96,P0.05)。對照組PSCsα-SMA m RNA表達(dá)量為1.00±0.05,造模組PSCsα-SMA m RNA相對表達(dá)量為9.76±0.28,造模組PSCsα-SMA m RNA表達(dá)量高于對照組,造模組和對照組PSCsα-SMA m RNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.78,P0.01)。結(jié)論:胰腺發(fā)生纖維化后胰腺星狀細(xì)胞發(fā)生激活,主要變現(xiàn)為α-SMA表達(dá)上調(diào);且胰腺發(fā)生纖維化后趨化因子CX3CL1的表達(dá)上調(diào)。第二部分IL-18對胰腺星狀細(xì)胞活化狀態(tài)及趨化因子CX3CL1表達(dá)的影響研究目的:探討不同濃度梯度IL-18對胰腺星狀細(xì)胞活化狀態(tài)的影響,以及對趨化因子CX3CL1表達(dá)的影響。研究方法:人胰腺星狀細(xì)胞株在星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng),傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板,每孔5x105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)后待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后向各孔中分別加入不同濃度梯度的IL-18(5、25、50、100ng/ml),觀察72小時(shí)后收集細(xì)胞,以未處理組為對照組,利用RT-PCR和Western Blot檢測E-cadherin、α-SMA、CX3CL1m RNA和蛋白表達(dá)情況,觀察IL-18是否能激活人PSCs;以及觀察IL-18能否上調(diào)PSCs中趨化因子CX3CL1表達(dá)。結(jié)果:對照組、5、25、50、100ng/ml IL-18處理組PSCs的E-cadherin m RNA表達(dá)量分別為1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06;α-SMA m RNA表達(dá)量分別為1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09;CX3CL1 m RNA表達(dá)量分別為1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13。相對于對照組,處理組E-cadherin m RNA的表達(dá)下調(diào),α-SMA及CX3CL1 m RNA表達(dá)上調(diào),其中100ng/ml處理組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)。對照組、5、25、50、100ng/ml IL-18處理組PSCs的E-cadherin蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06;α-SMA蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02;CX3CL1蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.03±0.05、1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12。處理組E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào),但各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào),IL-18 25ng/ml處理組和對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);IL-18 50ng/ml處理組和對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);IL-18 100ng/ml處理組和對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值0.01);CX3CL1蛋白表達(dá)上調(diào),其中IL-18 100ng/ml處理組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值0.05)。結(jié)論:IL-18能激活人胰腺星狀細(xì)胞,表現(xiàn)為α-SMA m RNA和蛋白表達(dá)上調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào);且IL-18能上調(diào)趨化因子CX3CL1的表達(dá)。第三部分PDTC能否緩解IL-18引起的胰腺星狀細(xì)胞激活及CX3CL1表達(dá)上調(diào)研究目的:驗(yàn)證NF-κB途徑抑制劑PDTC能否緩解IL-18引起的胰腺星狀細(xì)胞激活及趨化因子CX3CL1表達(dá)上調(diào)。研究方法:人胰腺星狀細(xì)胞株在星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng),傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板,每孔5X105個(gè)細(xì)胞,待各孔細(xì)胞融合度達(dá)到80%以后加藥。實(shí)驗(yàn)分為4各組,PDTC處理組(10μmol/L、30μmol/L)、IL-18處理組、正常對照組。利用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測法檢測E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 m RNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:對照組、IL-18處理組、PDTC(10μmol/L)+IL-18處理組、PDTC(30μmol/L)+IL-18處理組E-cadherin m RNA表達(dá)量為1.01±0.08,0.47±0.03,0.51±0.11,0.90±0.10,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.64,P0.01);各組α-SMA m RNA表達(dá)量分別為1.02±0.16,4.22±0.57,4.05±0.44,1.82±0.17,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.88,P0.01);各組CX3CL1 m RNA表達(dá)量分別為1.01±0.12,2.38±0.19,2.51±0.19,1.37±0.13,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.62,P0.01)。PDTC(10μmol/L、30μmol/L)+IL-18處理組與IL-18處理組相比,E-cadherin m RNA表達(dá)上調(diào),α-SMA、CX3CL1 m RNA表達(dá)下調(diào),差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組、IL-18處理組、PDTC(10μmol/L)+IL-18處理組、PDTC(30μmol/L)+IL-18處理組E-cadherin蛋白表達(dá)量為1.03±0.08,0.40±0.02,0.49±0.09,1.09±0.04,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.04,P0.01);各組α-SMA蛋白表達(dá)量分別為1.07±0.08,1.87±0.21,1.92±0.21,1.34±0.08,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.82,P0.05);各組CX3CL1蛋白表達(dá)量分別為1.02±0.04,1.38±0.14,1.61±0.08,1.28±0.04,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.01,P0.01)。PDTC(30μmol/L)+IL-18處理組與IL-18處理組相比,E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)且表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),α-SMA和CX3CL1蛋白表達(dá)下調(diào)且表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:PDTC不能緩解IL-18引起的胰腺星狀細(xì)胞激活,且不能下調(diào)趨化因子CX3CL1表達(dá)。
[Abstract]:鎱㈡，

本文編號：2118846