本文選題：叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白O1 + 法尼醇受體　； 參考：《江蘇大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白(Fox家族)是一組進(jìn)化過程中保守的轉(zhuǎn)錄因子,有100個以上的成員,其在分化、增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和代謝方面起著很重要的作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn),FoxO有FoxO1、Fox03、Fox04和Fox06,它們在哺乳動物的代謝和生長中起著關(guān)鍵的作用,而FoxO1則與代謝性疾病關(guān)系最為密切。近年來體外研究發(fā)現(xiàn),FoxO1去磷酸化后,從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi),啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵因素,并可能影響肝臟中膽固醇向膽囊的轉(zhuǎn)運。在代謝研究中發(fā)現(xiàn),FoxO1在肝臟內(nèi)的過表達(dá)會增加甘油三酯的蓄積和減少脂肪酸的氧化。而流行病學(xué)研究表明,高膽固醇血癥與膽石癥并無正相關(guān)性,而與高甘油三酯血癥有關(guān)。因此,FoxO1在肝臟的過表達(dá),可能就是膽固醇結(jié)石形成的機理所在。代謝綜合征狀態(tài)下,FoxO1的下游分子具有影響脂質(zhì)代謝和糖代謝的作用,其影響過程在于FoxO1的去磷酸化狀態(tài)。生理濃度的胰島素抑制FoxO1,導(dǎo)致刺激Cyp7a1基因轉(zhuǎn)錄,繼而增加膽汁酸的合成。基于以上理論,本課題的研究通過體外FoxO1過表達(dá)及下調(diào)等途徑,分析研究其下游調(diào)節(jié)膽石成因相關(guān)基因的表達(dá);并應(yīng)用重組FoxO1或發(fā)夾小干擾RNA病毒,建立成年小鼠的體內(nèi)FoxO1過表達(dá)或下調(diào)的模型,以期揭示FoxO1與膽固醇結(jié)石形成的直接分子機制。目的:應(yīng)用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株,利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株,觀察脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)情況。構(gòu)建小鼠FoxO1基因shRNA重組腺病毒載體和FoxO1基因過表達(dá)重組腺病毒載體,并經(jīng)C57BL/6小鼠體內(nèi)應(yīng)用,分析FoxO1基因參與膽固醇結(jié)石形成的機制,探討靶向調(diào)控核受體FOX01預(yù)防膽固醇結(jié)石形成的可行性。方法:一.FOXO1對人肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的體外研究(一)FOXO1基因的克隆:應(yīng)用PCR技術(shù)從人肝組織克隆FOXO1基因,選用pEZ_Lv203慢病毒作為載體,借助測序以鑒定結(jié)果。(二)shRNA干擾靶點序列的設(shè)計與合成:針對目的基因人FOXO1序列,利用軟件設(shè)計并合成三對shRNA干擾靶點序列,送吉瑪生物科技(上海)有限公司合成,測序鑒定結(jié)果。(三)過表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的建立1.構(gòu)建人FOXO1基因過表達(dá)重組慢病毒載體:利用PCR技術(shù)從人肝組織克隆FOXO1基因,選用pEZ_Lv203慢病毒載體,送廣州復(fù)能公司合成、包裝并純化pEZ-FOXO1 慢病毒。2.穩(wěn)定過表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的篩選與鑒定:(1)包裝好FOXO1過表達(dá)重組慢病毒感染HepG2細(xì)胞,72小時收集細(xì)胞,提取RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1mRNA的表達(dá)情況,Western Blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)情況(2)用1.0 μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的HepG2細(xì)胞株,96小時后收集細(xì)胞,提取RNA的蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1 mRNA的表達(dá)情況,Western Blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)情況。(3)培養(yǎng)、收集過表達(dá)FOXO1的HepG2穩(wěn)定細(xì)胞株,提取總RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測各基因mRNA的表達(dá),對mRNA表達(dá)有差異的基因,用Western Blot檢測其蛋白的表達(dá)。(五)穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的建立1.構(gòu)建人FOXO1基因shRNA重組慢病毒載體:針對目的基因人FOXO1序列,利用軟件設(shè)計并合成三對shRNA干擾靶點序列,送吉瑪生物科技(上海)有限公司合成、包裝并純化FOXO1 shRNA干擾慢病毒。2.穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的篩選與鑒定:(1)包裝好FOXO1shRNA干擾慢病毒感染HepG2細(xì)胞,96小時后收集細(xì)胞,提取RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1 mRNA的表達(dá)情況,Western Blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)情況。(2)用1.0 μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的HepG2細(xì)胞株,96小時后收集細(xì)胞,提取RNA的蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1的mRNA,Western Blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)情況。(3)培養(yǎng)、收集低表達(dá)FOXO1的HepG2穩(wěn)定細(xì)胞株,提取總RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測各基因的mRNA。對mRNA表達(dá)有差異的基因,用Western Blot檢測其蛋白的表達(dá)情況。(六)實時熒光定量PCR (qRT-PCR):根據(jù)PAXgeneRNAkit操作說明書提取細(xì)胞總RNA,瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100檢測RNA完整性。按照ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照ABIlifetechTaqman基因表達(dá)分析體系說明書在ABI7900上檢測基因表達(dá)。擴增后結(jié)果采用2-△△Ct法對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。(七)Western Blot:收集細(xì)胞,加入細(xì)胞蛋白裂解緩沖液,采用超聲破碎細(xì)胞。采用BCA法檢測蛋白濃度。稀釋至相同濃度后上樣,5%濃縮膠電泳80V 30 min,換120V,10%分離膠繼續(xù)電泳60min。400mA轉(zhuǎn)膜120min; 5%脫脂牛奶封閉兩小時后,加一抗過夜;二抗孵育2h,顯影拍照。采用ImageJ分析軟件分析結(jié)果。二、Fox01基因與膽固醇結(jié)石形成的體內(nèi)研究(一)FoxO1基因的克隆:利用PCR技術(shù)從小鼠肝組織克隆FoxO1基因,選用PDC316-MCS2腺病毒載體,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒M_3_3Flag-FoxO1,利用測序、Western Blot方法進(jìn)行結(jié)果鑒定。(二)shRNA干擾靶點序列的設(shè)計與合成:針對目的基因FoxO1序列,利用軟件設(shè)計并合成三對shRNA干擾靶點序列,送吉滿生物科技(上海)有限公司合成,分別插入載體PGMAV-S1腺病毒載體,利用測序、Western Blot方法進(jìn)行結(jié)果鑒定。(三)采用AdMax系統(tǒng)包裝腺病毒,CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒,梯度稀釋法檢測病毒滴度。(四)動物分組與處理:將40只C57BL/6小鼠隨機分為四組,分別經(jīng)尾靜脈注射對FoxO1基因的shRNA腺病毒(FOXO1-shRNA組)、針對FoxO1基因的shRNA空白載體組(shRNA對照組)、FoxO1基因過表達(dá)腺病毒(FOXO1-OE組)、FoxO1基因過表達(dá)腺病毒空白載體組(FOXO1-OE對照組),給予膽固醇成石飼料喂養(yǎng)。FoxO1干擾對照組及FoxO1干擾組喂養(yǎng)6周,FoxO1過表達(dá)對照組及FoxO1過表達(dá)組喂養(yǎng)4周后處死。處死前禁食12小時,自由飲水。(五)檢測標(biāo)本留取:上述各組小鼠用戊巴比妥(4.5mg/100g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉,眶周靜脈取血,離心取血清-80℃保存。采用腹部正中切口,暴露膽囊,觀察有無結(jié)石,結(jié)扎膽囊管切除膽囊于液氮凍存。采集肝臟凍于-80℃保存至檢測。(六)膽汁中膽固醇、磷脂和膽汁酸的測定:取20 μL膽汁,加入180μL生理鹽水稀釋10倍,羅氏ModularP全自動生化檢測儀檢測。利用Carey表計算膽固醇飽和指數(shù)(Cholesterol saturation index,CSI)。(七)熒光定量PCR檢測C57BL/6小鼠肝臟脂類代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)變化,對于mRNA表達(dá)有差異的基因,用Western Blot檢測其蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.篩選出穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1及過表達(dá)FOXO1的細(xì)胞株各一株(1)篩選的shRNA慢病毒命名為LV3-FOXO1-shRNA2。在RNA水平:感染72小時及96小時,相對于空白對照的相對表達(dá)量為0.17和0.19;在蛋白水平:感染72小時及96小時,相對于空白的相對表達(dá)量為0.899和0.848。而過表達(dá)慢病毒pEX-FOXO1,在RNA水平:感染72小時及96小時,相對于空白相對表達(dá)量為8.94和6.17;在蛋白水平:感染72小時及96小時,相對于空白相對表達(dá)量為0.027和1.400。(2)篩選培養(yǎng)96小時后,LV3-FOXO1-shRNA2 mRNA表達(dá)為空白對照的0.527(n=3,P0.05),蛋白表達(dá)為空白對照的0.62 (n=3,P0.05) ; pEX-FOXO1mRNA表達(dá)為空白對照的105.10 (n=3, P0.05),蛋白表達(dá)為空白對照的2.01 (n=3,P0.05)。2. FOXO1對CYP7A1及FXR基因表達(dá)的影響FOXO1基因低表達(dá)時,CYP7A1基因表達(dá)上調(diào)約4倍(t==21.03, P0.01),FXR基因上調(diào)約1.4倍(t=3.047,P0.05) ; FOXO1高表達(dá)時,CYP7A1基因表達(dá)下調(diào)約4倍(t=21.85, P0.01),FXR基因下調(diào)約0.8倍(t=12.62, P0.05),具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.成功構(gòu)建FoxO1過表達(dá)及FoxO1低表達(dá)腺病毒載體(1) FoxO1過表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取蛋白。Western Blot檢測結(jié)果顯示構(gòu)建載體能在293T細(xì)胞表達(dá),提示載體構(gòu)建成功。(2)構(gòu)建的三個FoxO1 shRNA干擾腺病毒感染鼠ST2細(xì)胞,培養(yǎng)72 h,提取總蛋白。根據(jù)Western blot結(jié)果選擇干擾效果最好的,繼續(xù)擴增,用于后續(xù)實驗。(3)擴增構(gòu)建的腺病毒滴度結(jié)果:獲得滴度為1X1011 PFU/mL的FoxO1過表達(dá)(FoxO1-OE)和FoxO1干擾(FoxO1-shRNA)腺病毒。4.體內(nèi)干預(yù)試驗結(jié)果(1) FoxO1過表達(dá)組及FoxO1過表達(dá)對照組,致石飲食喂養(yǎng)4周后,麻醉處死,觀察膽囊成石情況,取標(biāo)本。FoxO1過表達(dá)對照組,4只成石(4/10),成石率40%;FoxO1過表達(dá)組,8只成石(8/10),成石率80%。FoxO1干擾組組及FoxO1干擾對照組,致石飲食喂養(yǎng)6周后,麻醉處死,觀察膽囊成石情況,取標(biāo)本。FoxO1干擾對照組,10只成石(10/10),成石率100%; FoxO1干擾組,2只成石(2/10),成石率20%。(2)與對照組相比,FoxO1干擾組膽囊膽汁總膽固醇明顯下降,總膽汁酸明顯升高,CSI明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義。磷脂變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義,呈降低趨勢。而FoxO1過表達(dá)組各指標(biāo)變化呈相反趨勢。(3)小鼠血清的血脂檢測結(jié)果顯示:與FoxO1干擾對照組相比,FoxO1干擾組小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL水平均下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TG、GLU及HDLC則沒有明顯差異。相對于FoxO1過表達(dá)對照組,FoxO1過表達(dá)組小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL均升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。TG、GLU沒有明顯差異。(4)基因相對表達(dá)量檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,FoxO1干擾組的基因Cyp7a1和Fxr表達(dá)明顯升高。而FoxO1過表達(dá)則呈相反結(jié)果。在FoxO1干擾的抗結(jié)石組我們發(fā)現(xiàn),Cyp7b1、Cyp8b1和Cyp27a1與對照組相比均呈上升趨勢,其中Cyp8b1升高明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義。(5)蛋白免疫印跡實驗顯示:與對照組相比,FoxO1干擾組的蛋白Cyp7a1和Fxr表達(dá)明顯升高。而FoxO1過表達(dá)組則呈相反結(jié)果。這一結(jié)果與基因研究結(jié)果相一致。結(jié)論:1.成功構(gòu)建FOXO1低表達(dá)和高表達(dá)慢病毒載體。感染HepG2后,篩選出低表達(dá)FOXO1和高表達(dá)FOXO1的穩(wěn)定細(xì)胞株,構(gòu)建了細(xì)胞模型。2.構(gòu)建了FoxO1低表達(dá)和高表達(dá)腺病毒載體,經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠,成功復(fù)制出低表達(dá)FoxO1和高表達(dá)FoxO 1的小鼠模型。3.隨著FOXO1基因表達(dá)水平的變化,CYP7A1和FXR基因的表達(dá)水平發(fā)生改變,而ABCG5、ABCG8、ABCB11等脂質(zhì)轉(zhuǎn)運基因沒有相應(yīng)的改變。提示,FOXO1基因可能通過影響膽固醇和膽汁酸的代謝而參與膽固醇結(jié)石的形成。體內(nèi)干預(yù)試驗結(jié)果也顯示,FoxO1在小鼠體內(nèi)過表達(dá)時具有一定的促成石作用。FoxO1的shRNA干擾腺病毒,在小鼠具有明顯的抗成石效果。提示FoxO1作為預(yù)防和治療膽囊膽固醇結(jié)石靶點的可行性。4.進(jìn)一步的機制研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)FoxO1基因表達(dá)發(fā)生變化時,引起Cyp7a1和Fxr基因的表達(dá)改變,而Abcg5、Abcg8、Abcb11等脂質(zhì)轉(zhuǎn)運基因沒發(fā)生相應(yīng)的改變。提示,FoxO1基因可能通過影響膽固醇和膽汁酸的代謝而參與膽固醇結(jié)石的形成。FoxO1低表達(dá)時,Cyp8b1表達(dá)增高,表明抑制FoxO1可能提高膽囊膽汁中膽酸和脫氧膽酸比例,從而促進(jìn)膽固醇的溶解。這也可能是其抗成石的機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉清;金俊哲;呂洪洋;邢保健;;膽囊結(jié)石的相關(guān)危險因素分析[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2016年12期

2 楊琳珊;占貞貞;汪波;楊s，

本文編號：2067005