本文關(guān)鍵詞：PTEN過(guò)表達(dá)及突變對(duì)肝星狀細(xì)胞黏附與遷移的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華北理工大學(xué)》 2015年

PTEN過(guò)表達(dá)及突變對(duì)肝星狀細(xì)胞黏附與遷移的影響

任昌鎮(zhèn)  

【摘要】：目的探討過(guò)表達(dá)的野生型第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)及其突變體G129E基因(僅保留蛋白磷酸酶活性而喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性)對(duì)體外培養(yǎng)的活化肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)黏附與遷移的影響。方法利用293A細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒(Ad-PTEN、Ad-G129E、AdGFP),并測(cè)定滴度;以腺病毒為載體將具有雙重特異性磷酸酶活性的野生型PTEN基因及僅保留了蛋白磷酸酶活性的PTEN突變體G129E基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化大鼠HSC(HSC-T6株);采用Western blot檢測(cè)HSC的PTEN蛋白表達(dá);應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色法及MTT比色法測(cè)定HSC黏附能力;采用細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定HSC的平面遷移能力;應(yīng)用Transwell小室測(cè)定HSC的跨膜遷移能力。所有資料均應(yīng)用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用LSD檢驗(yàn),P0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)分組如下:①對(duì)照組(Control組):病毒轉(zhuǎn)染時(shí)以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替腺病毒;②空病毒組(Ad-GFP組):轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的載體空病毒;③PTEN重組腺病毒組(Ad-PTEN):轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒;④G129E重組腺病毒組(Ad-G129E組):轉(zhuǎn)染攜帶G129E基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒。結(jié)果1通過(guò)反復(fù)感染293A細(xì)胞的方法,獲得實(shí)驗(yàn)所需腺病毒液Ad-GFP、AdPTEN及Ad-G129E,其滴度分別為:1.6×109pfu/m L、1.3×109pfu/m L、1.4×109pfu/m L。2 M.O.I.值100時(shí),腺病毒感染HSC后48h,計(jì)數(shù)GFP熒光陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,測(cè)的Ad-GFP、Ad-PTEN及Ad-G129E各組腺病毒感染率均80%。3腺病毒轉(zhuǎn)染后48h,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組HSC的PTEN蛋白表達(dá)顯示:Ad-PTEN組(1.08±0.07)、Ad-G129E組(0.97±0.04)明顯高于Control組(0.56±0.05)及AdGFP(0.69±0.07),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而Control組與Ad-GFP組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間均無(wú)顯著差異(P0.05)。4甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定HSC黏附力顯示:在腺病毒感染HSC 48h,與Control組相比,Ad-GFP組細(xì)胞黏附抑制率(1.89±0.88)%,無(wú)顯著差異(P0.05);Ad-PTEN組細(xì)胞黏附抑制率(20.38±4.37)%及Ad-G129E組細(xì)胞黏附率(19.57±3.78)%顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間細(xì)胞黏附率無(wú)顯著差異(P0.05)。5 MTT比色法檢測(cè)HSC黏附力顯示:與Control組相比,Ad-GFP組細(xì)胞黏附抑制率(6.17±4.98)%,無(wú)顯著差異(P0.05);Ad-PTEN組細(xì)胞黏附抑制率(38.13±6.93)%及Ad-G129E組細(xì)胞黏附率(35.83±4.24)%顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間細(xì)胞黏附率無(wú)顯著差異(P0.05)。6細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:劃痕后12h各組HSC均有遷移,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);劃痕后24h HSC由兩側(cè)向中間遷移距離,Ad-PTEN組(332.35±6.23μm)、Ad-G129E組(336.77±5.25μm)明顯低于Control組(391.34±10.41μm)及Ad-GFP組(392.66±10.41μm)(P0.05),而Control組與Ad-GFP組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間均無(wú)顯著差異(P0.05);劃痕后48h HSC由兩側(cè)向中間遷移距離,與Control組(551.68±8.91μm)相比,Ad-PTEN組(468.74±19.29μm)及Ad-G129E組(462.48±13.47μm)明顯減低(P0.05),且較24小時(shí)降低更加明顯,而Ad-GFP組(550.81±11.55μm)與Control組及Ad-PTEN組與Ad-G129E組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7 Transwell小室細(xì)胞跨膜遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Ad-PTEN組跨膜細(xì)胞數(shù)(38.67±4.50)、Ad-G129E組跨膜細(xì)胞數(shù)(33.33±3.83)較Control組(67.67±6.28)及Ad-GFP組(64.67±5.53)顯著減少(P0.05),而Ad-PTEN組與Ad-G129E組及Control組與Ad-GFP組之間跨膜細(xì)胞數(shù)均無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論1野生型PTEN過(guò)表達(dá)可顯著抑制活化HSC黏附、遷移。2 PTEN的突變體G129E對(duì)活化HSC黏附、遷移的抑制作用,與野生型PTEN相比無(wú)顯著差異。3 PTEN基因通過(guò)其蛋白磷酸酶活性對(duì)活化HSC黏附、遷移發(fā)揮抑制作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

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7 施貴靜;干擾素-γ對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)影響研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2005年

8 陳興洲;肝星狀細(xì)胞自噬現(xiàn)象的特征鑒定及其生物學(xué)意義的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

9 陳峰杰;內(nèi)毒素對(duì)肝星狀細(xì)胞表達(dá)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2013年

10 李芊蔚;TGF-β_1對(duì)HSC活化及阻斷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2013年

  本文關(guān)鍵詞：PTEN過(guò)表達(dá)及突變對(duì)肝星狀細(xì)胞黏附與遷移的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：200269