本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞來源exosomes對大鼠急性胰腺炎損傷后修復(fù)作用的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《川北醫(yī)學(xué)院》 2015年

骨髓間充質(zhì)干細胞來源exosomes對大鼠急性胰腺炎損傷后修復(fù)作用的實驗研究

徐均  

【摘要】：研究背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種嚴重威脅人們生命健康的急腹癥,病情發(fā)展迅速,救治難度大,死亡率極高。目前認為胰酶異常激活、白細胞過度激活以及炎性因子級聯(lián)反應(yīng)是致使AP發(fā)病及迅速發(fā)展的重要因素。尤其在早期白細胞過度激活促使大量促炎因子釋放,嚴重破壞機體促炎與抗炎間的平衡,致使肝、腎、肺以及小腸等全身多器官受到不同程度的損傷,也是其致死的重要原因之一。有研究證實骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)通過強大的抗炎與組織修復(fù)作用能夠明顯改善急性胰腺炎患者的預(yù)后,但臨床也出現(xiàn)由不良分化所致惡變、心肌鈣化、肺纖維化以及由細胞輸注導(dǎo)致血管閉塞等并發(fā)癥。最近,研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以釋放一類由真核細胞的內(nèi)吞體產(chǎn)生并被分泌出細胞的膜性囊泡exosomes(即BMSCs-exosomes),能夠發(fā)揮出與BMSCs移植相似的生物學(xué)效應(yīng),同時也可以消除BMSCs移植的潛在安全隱患。目前,尚未見報道關(guān)于BMSCs-exosomes干預(yù)治療AP的相關(guān)研究。因此,本課題擬通過分離提純與鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源exosomes,然后通過建立SD大鼠AP模型,初步探討B(tài)MSCs-exosomes對大鼠急性胰腺炎損傷后修復(fù)作用及可能的作用機理,為深入研究BMSCs-exosomes替代MSCs臨床治療AP提供一定的理論基礎(chǔ)。第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源exosomes的分離提純與鑒定目的:通過對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞提取分離與原代培養(yǎng),以及分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞來源exosomes(BMSCs-exosomes),為后續(xù)的動物干預(yù)實驗做準(zhǔn)備。方法:分離提取健康成年的雄性SD大鼠股骨髓腔內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細胞,體外進行原代培養(yǎng)至第三代,收集細胞培養(yǎng)的上清液,采用Exo Quick-TC exosomes提取試劑盒分離提取培養(yǎng)上清液中骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的exosomes,并通過負染透射電鏡進行BMSCs-exosomes鑒定。結(jié)果:BMSCs原代細胞經(jīng)經(jīng)上訴培養(yǎng)方法,細胞在48小時后逐漸貼壁,8-11d鏡下呈梭形或多角形的多樣性,約兩周覆蓋了整個可見的細胞培養(yǎng)瓶壁;細胞培養(yǎng)至第三代,其形狀逐漸呈較均勻的長梭形,流式細胞檢測結(jié)果,證實該細胞群為CD90+CD44+CD45-的BMSCs細胞群。分離提取培養(yǎng)上清液中骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的BMSCs-exosomes,并經(jīng)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)為圓形或橢圓形的小囊泡,直徑30~100 nm,包膜完整且囊內(nèi)含有低電子密度物質(zhì)。結(jié)論:本部分實驗成功獲得穩(wěn)定培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞,并且經(jīng)過分離提純后獲得高純度的BMSCs-exosomes,為后續(xù)的體內(nèi)動物干預(yù)實驗做好準(zhǔn)備。第二部分BMSCs來源的exosomes對大鼠急性胰腺炎損傷后修復(fù)作用目的:通過建立SD大鼠急性胰腺炎動物模型,觀察BMSCs來源的exosomes能否減輕急性胰腺炎大鼠的病情,能否對其胰腺損傷具有保護或修復(fù)作用。方法:通過L-精氨酸腹腔注射的方法建立AP動物模型,將50只清潔級SD大鼠隨機分為5組,每組10只:(對照組、AP組、PBS組、BMSCs組、BMSCs-exosomes組),觀察各實驗組大鼠指標(biāo)血清淀粉酶、炎癥因子TNF-α、IL-6及抑炎因子IL-10表達水平,胰腺組織、肺組織病理評分,胰腺細胞凋亡及凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2蛋白表達水平。結(jié)果:AP組血清淀粉酶水平顯著高于對照組(P0.05),表明成功建立大鼠胰腺炎模型;PBS組與BMSCs組和BMSCs-exosomes組血清淀粉酶相比較,差異顯著(P0.05);BMSCs組和BMSCs-exosomes組相比較無明顯差異(P0.05)。BMSCs-exosomes組、BMSCs組血清中TNF-α、IL-6、含量低于PBS組(P0.05);BMSCs-exosomes組、BMSCs組血清中IL-10含量高于PBS組(P0.05),BMSCs-exosomes組與BMSCs組血清中TNF-α、IL-6、IL-10相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。BMSCs組(7.30士0.79)、BMSCs-exosomes組(7.82士0.91)胰腺病理評分顯著低于PBS組(10.31士0.85)(P0.05)。BMSCs組與BMSCs-exosomes組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。AP組凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。BMSCs組、BMSCs-exosomes組凋亡指數(shù)顯著低于PBS組(P0.05)。BMSCs組與BMSCs-exosomes組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)與PBS組相比,BMSCs組與BMSCs-exosomes組胰腺基因Bax蛋白表達水平明顯降低(P0.05),不論在PBS組還是BMSCs組與BMSCs-exosomes組,均有較弱的基因Bcl-2蛋白表達,各組動物相應(yīng)時間點基因Bcl-2蛋白表達水平無顯著差異性(P0.05)。結(jié)論:本部分實驗通過腹腔分次注射L-精氨酸誘成功建立了急性胰腺炎大鼠動物模型,然后經(jīng)過尾靜脈注射分離純化的BMSCs來源的exosomes,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs-exosomes與BMSCs對急性胰腺炎有相似的治療作用,都可能是通過抑制胰腺細胞的凋亡、促進細胞增殖的機制,從而對急性胰腺炎大鼠胰腺損傷發(fā)揮修復(fù)作用;并且同時通過調(diào)節(jié)促炎因子與抑炎因子的平衡,減輕炎癥反應(yīng)對組織器官細胞的損傷,起到保護器官功能的作用。由此,該結(jié)果為BMSCs-exosomes可完全替代BMSCs移植治療急性胰腺炎提供一定的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R576
【目錄】：

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