本文選題：GP73 + RNA-seq�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2014年博士論文

【摘要】：肝癌(hepatic cell cancer, HCC)是臨床上死亡率很高的一種腫瘤。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,alpha fetoprotein, AFP)是目前臨床上唯一用于HCC監(jiān)測的血清標(biāo)志物,其靈敏度和特異性均有待提高。近年來研究報道顯示高爾基體糖蛋白73(Golgi protein73, GP73)用于臨床診斷肝癌的敏感性和特異性均顯著高于AFP,提示我們GP73是最有前景的肝癌診斷的血清標(biāo)志物。GP73又叫GOLM1(golgi membrane protein1)或者GOLPH2(golgi phosphoprotein2),它是一種常駐高爾基體的Ⅱ型跨膜糖蛋白。人體正常肝組織的肝細(xì)胞表達(dá)很少甚至不表達(dá)中,但膽管上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈。 一、臨床患者血清中GP73水平的特征分析：本研究收集了2242份血清標(biāo)本用來完成GP73在臨床患者血清中表達(dá)的特征分析研究,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫定量測定方法和免疫組化方法進(jìn)行GP73的測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)在正常人群中GP73的水平呈正態(tài)分布,GP73的濃度與性別無關(guān),與年齡相關(guān),隨著年齡的增長,其表達(dá)含量有增加的趨勢,其中青年組和老年組差異顯著(P0.001),提示血清中GP73水平與老年組人群肝臟的衰老和損傷可能相關(guān)。(2)與健康人群相比,GP73在終末期肝病患者血清中的水平最高,其他腫瘤、病情較輕的肝病以及炎癥患者中體內(nèi)GP73水平雖然出現(xiàn)上調(diào),但幅度低于終末期肝病患者,表現(xiàn)出較明顯的肝臟特異性。(3)ROC曲線分析GP73在區(qū)分健康人群與肝癌時其診斷準(zhǔn)確度能夠達(dá)到91.9%,即使在慢性乙肝患者人群中檢測GP73的診斷準(zhǔn)確度也能達(dá)到82.7%,顯示出良好的診斷價值,明確血清中GP73的檢測可以作為肝癌標(biāo)志物。(4)在擬行器官移植的肝病患者術(shù)前血清中GP73的含量顯著高于終末期腎病患者,大部分肝、腎器官移植術(shù)后患者血清中GP73水平均出現(xiàn)明顯的下降,生存曲線分析顯示肝移植患者術(shù)后GP73升高與患者的生存和腫瘤復(fù)發(fā)有明顯的相關(guān)性,提示GP73與疾病進(jìn)程的關(guān)系密切,特別是在AFP陰性的肝癌移植人群,術(shù)后監(jiān)測GP73能夠讓患者受益。(5)發(fā)現(xiàn)肝癌組織GP73呈現(xiàn)出典型的胞漿彌散和包膜濃染的現(xiàn)象,明確肝癌組織和肝硬化組織中GP73表達(dá)模式不一致,提示肝癌細(xì)胞中GP73表達(dá)可能出現(xiàn)了定位改變。(6)慢性乙肝患者中ALT的水平與GP73的水平呈正相關(guān),提示GP73的高表達(dá)可能與肝臟損傷有關(guān)。以上結(jié)果提示我們GP73具有肝癌和肝臟損傷標(biāo)志物的雙重特性,與肝損傷和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。 二、GP73的生物學(xué)功能研究：我們的實驗結(jié)果顯示GP73在炎癥、肝臟損傷、腫瘤發(fā)生時都不同程度高表達(dá),而GP73是人體高爾基體的正常組分,應(yīng)該在正常的生物活動中行使相應(yīng)的功能,但目前其在蛋白質(zhì)分泌、成熟中的作用等生物學(xué)功能研究尚不明確。從GP73的分布來看,GP73在人體大部分的組織中表達(dá),其mRNA和蛋白在不同組織中表達(dá)水平有明顯差異,推測該蛋白質(zhì)具有管家基因功能,可能具有有效的調(diào)控能力以及多種功能。已有報道證實GP73對維持機(jī)體的正常生存是不可或缺的,在GP73的C末端截短后小鼠患有嚴(yán)重的肝腎損傷且在18個月的生存率明顯降低。另外,有研究小組發(fā)現(xiàn)GP73與分泌性叢生蛋白有相互作用、GP73可能以二聚體的形式行使其功能。這些結(jié)果提示GP73應(yīng)該在炎癥、肝臟損傷和腫瘤的發(fā)生中具有重要功能,通過基礎(chǔ)的細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)實驗,我們的研究發(fā)現(xiàn)： 1.GP73高表達(dá)后影響多種信號傳導(dǎo)通路：以乳腺癌和肝癌細(xì)胞為模型,通過RNA-seq高通量測序方法,發(fā)現(xiàn)(1)GP73高表達(dá)在兩種細(xì)胞系中均引發(fā)了大量信號肽基因的高表達(dá),誘導(dǎo)了具有分泌功能,二硫鍵結(jié)合等相關(guān)基因的富集；(2)GP73過表達(dá)誘導(dǎo)了RASGRP2、STAT2、GTPase以及G蛋白偶連跨膜受體等基因的富集；(3)GP73過表達(dá)誘導(dǎo)了大量趨化因子的富集；(4)GP73過表達(dá)引起細(xì)胞防御信號途徑中大量基因的高表達(dá)。(5)GP73過表達(dá)引起細(xì)胞防御信號途徑中大量基因的高表達(dá)。(6)GP73過表達(dá)后,肝癌細(xì)胞系中的膽固醇通路被上調(diào)15倍以上,是被上調(diào)幅度最大的信號通路。以上結(jié)果提示我們GP73高表達(dá)主要參與了調(diào)控細(xì)胞防御、細(xì)胞生長以及細(xì)胞代謝等相關(guān)信號通路。 2.GP73促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長以及裸鼠成瘤：通過構(gòu)建GP73穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和GP73RNAi敲低的穩(wěn)定細(xì)胞系,利用細(xì)胞生長實驗、瞬時轉(zhuǎn)染方法,細(xì)胞同步化實驗、裸鼠成瘤實驗、流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)以及RNA干擾手段發(fā)現(xiàn)(1)GP73穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的生長速度與對照細(xì)胞相比明顯增快；(2)野生型和GP73糖基化雙突變體的過表達(dá)均能促進(jìn)細(xì)胞生長；(3)GP73過表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程明顯加快；(4)發(fā)現(xiàn)GP73-siRNA組的腫瘤瘤體體積明顯小于對照組的瘤體體積。以上結(jié)果提示我們GP73可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長以及裸鼠成瘤。 3.GP73參與炎癥發(fā)生：利用攜帶有干擾素啟動子的熒光素酶報告基因、NDV-GFP病毒感染細(xì)胞為模型,通過免疫印跡方法、免疫熒光方法、熒光顯微鏡技術(shù)和ELISA檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)(1)GP73過表達(dá)能夠誘導(dǎo)激活先天性免疫應(yīng)答信號通路；(2)GP73過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)pro-caspase-1的總量明顯增高；(3)GP73過表達(dá)后炎癥小體復(fù)合物被激活;(4)發(fā)現(xiàn)GP73過表達(dá)顯著抑制病毒的復(fù)制：(5)GP73以及GP73糖基化雙突變體過表達(dá)后,細(xì)胞內(nèi)Fillipin染色明顯增強(qiáng)；脂筏在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集,這種點(diǎn)狀聚集與GP73呈現(xiàn)共定位；(7)人血清中GP73的高表達(dá)與膽固醇低水平之間具有正相關(guān)性。以上結(jié)果提示我們GP73很有可能通過炎癥信號通路以及代謝信號通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。 4.GP73與TGF-β信號通路之間關(guān)系：通過免疫印跡實驗和RNA干擾方法發(fā)現(xiàn)(1)較低濃度的TGF-β上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)GP73的表達(dá),而較高濃度的TGF-β則下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)GP73的表達(dá)；(2)細(xì)胞內(nèi)GP73的水平與Smad3的磷酸化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；(3)GP73以及GP73糖基化雙突變體過表達(dá)后,顯著抑制了由TGF-β介導(dǎo)的p21、smad3-p以及E-cadherin的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)了由TGF-β介導(dǎo)的vimentin的下調(diào)；(4)TGF-β在GP73敲低的細(xì)胞系中可以誘導(dǎo)更高水平的p21表達(dá)。以上結(jié)果提示我們GP73與TGF-β信號通路之間具有反饋關(guān)系。 總之,本研究通過臨床大樣本GP73含量的橫斷面調(diào)查,明確了人體血清中GP73的表達(dá)受到炎癥刺激、肝臟損傷、腫瘤發(fā)生的影響,且與移植術(shù)后存活率有一定的相關(guān)性,特別是在臨床患者血清中表現(xiàn)出肝癌和肝臟損傷標(biāo)志物的雙重特性,顯示出較高的臨床應(yīng)用價值。在GP73生物學(xué)功能研究中,發(fā)現(xiàn)GP73與先天性免疫信號通路、炎癥小體信號通路以及腫瘤信號通路均有不同程度的作用,GP73過表達(dá)可以刺激細(xì)胞生長、縮短細(xì)胞周期、改變脂閥中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響膽固醇穩(wěn)態(tài)來參與肝癌發(fā)生。
[Abstract]:Liver cell cancer ( HCC ) is a kind of tumor with high clinical mortality . AFP is the only serum marker for HCC monitoring in clinic . The sensitivity and specificity of GP73 are higher than that of AFP . It is suggested that GP73 is the most promising serum marker for liver cancer diagnosis . GP73 is also called GOLM1 ( golgi membrane protein1 ) or GOLPH2 ( golgi phosphoprotein 2 ) , which is a kind of type 鈪，

本文編號：1913493