本文關(guān)鍵詞：中國乙型肝炎病毒基因型間重組的鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學》 2014年

中國乙型肝炎病毒基因型間重組的鑒定

潘登  

【摘要】：研究背景 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?并可引起多器官損害的一種疾病。乙型肝炎病毒感染造成的乙型肝炎,以及乙型肝炎相關(guān)性疾病如肝硬化、肝細胞癌等肝臟疾病嚴重威脅著人類健康,已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)。 乙型肝炎病毒是屬于嗜肝DNA病毒科的一種部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒,基因組全長只有約3200bp,是已知最小的DNA病毒。至今為止,依據(jù)乙型肝炎病毒的遺傳異質(zhì)性,按HBV基因組全長序列的差異大于8%的標準,HBV可分為8個公認的基因型A-H。另外尚有2個暫時命名的基因型：由A/C/G型重組形成的I基因型和1例分離自日本的不屬于已知A-I基因型和4種猿類HBV的病毒株形成的J基因型。另外根據(jù)基因組全長序列的基因異質(zhì)性大于4%的標準,在基因型內(nèi)還可細分為不同的基因亞型。伴隨種族的不同和人口遷徙的歷史原因,HBV基因型具有明顯的地理分布特征：基因型A主要分布于歐洲、北美、南美及非洲地區(qū),基因型B和C主要分布在東亞和東南亞地區(qū),基因型D呈全球分布性趨勢,尤其流行于地中海地區(qū)、中東、南亞和大洋洲,基因型F主要分布于中美洲和南美洲,基因型E、G和H則一般分別局限分布于撒哈拉以南非洲、美國和中美洲地區(qū)。近年來在越南、老撾、印度和中國西南地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了新的疑似基因型I的HBV流行株。 基因重組在HBV不同基因型間并不少見,如廣泛分布在東南亞地區(qū)的Ba基因型病毒株被普遍認為是由B和C基因型重組形成的。隨著生物信息學技術(shù)的發(fā)展及基因重組探測軟件的出現(xiàn),基因型之間的重組事件在HBV相關(guān)性的系統(tǒng)進化分析研究中被相繼發(fā)現(xiàn),例如中國西北地區(qū)和印度的C/D重組體,意大利和南非的A/D重組體,非洲喀麥隆的A/E重組體、泰國的C/G重組體等。然而,不同基因型之間的重組機制到目前為止仍未明確,基因重組被認為是HBV基因變異的重要機制之一,同時也是基因進化過程中的重要動力。 研究目的 中國是個HBV高感染率國家,有必要對中國地區(qū)的HBV基因組進行一次全面系統(tǒng)的重組體篩查,因此,本文旨在運用生物信息學方法探索中國地區(qū)的HBV基因型之間的重組事件、重組位點和分布規(guī)律。 對象和方法 本次實驗以HBV基因重組的片段分型法為基礎(chǔ),通過進一步改進,對中國地區(qū)的人HBV基因型重組進行檢測鑒定,具體方法如下：首先從NCBI的GenBank中下載來自中國包括香港和臺灣地區(qū)的人HBV全基因組序列,截止時間是2013年11月20日。從數(shù)據(jù)庫中相關(guān)的序列詳細信息及相關(guān)文獻中獲得每條基因組序列的資料,并通過實驗對象納入標準即排除基因組序列全長少于3000bp及未知核苷酸數(shù)多于50的序列,剔除不同版本的相同序列和人工突變的全長序列。構(gòu)建中國人HBV基因全長序列數(shù)據(jù)庫,合計得到1642條序列用于本實驗的重組分析,將所有核苷酸序列的起點調(diào)整至EcoRI位點,便于序列比對。 然后通過GenBank中HBV全基因組序列資料和序列相關(guān)參考文獻中已知的基因型信息,下載每個基因型的所有序列并通過這些序列建立8個基因型A-H的一致性序列。運用MEGA5.21軟件中的Muscle方法比對8條基因型一致性序列,將比對后的一致性序列切割成13個片段,每個片段約為250bp。以此104個一致性序列片段為數(shù)據(jù)庫,用1642條來自中國的HBV全基因組序列對該數(shù)據(jù)庫做blast分析,按照最大序列相似性原則,得到每條全長序列上的對應(yīng)數(shù)據(jù)庫中一致性序列的片段的最可能基因型,因此每條全長基因組序列的基因型都可以表示為13個相應(yīng)片段的基因型組合。并分析每條HBV全基因組的基因型組合,若序列基因型組合的13個基因型不一致則考慮為疑似重組序列,進入下一輪重組篩查。剔除13個基因型一致的全長序列,剩余的序列再次進行多重比對,并將比對后的序列切割為13個片段。以8條一致性全序列為數(shù)據(jù)庫,用二次篩查中切割的所有片段對此數(shù)據(jù)庫做Blast分析,若每條序列的13個片段的最大可能基因型全部一致,則不考慮為重組序列；反之,則考慮為疑似重組序列,序列13個片段中占較小比例的非一致基因型的片段作為疑似重組片段進一步通過系統(tǒng)發(fā)育分析校正片段基因型。利用MEGA5.21軟件,與8條一致性全長序列,每個基因型隨機2條全長序列及1條外群序列的相對應(yīng)片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。 最后運用Simplot軟件對疑似重組序列進行重組事件的鑒定,以疑似重組序列與2條親本一致性序列和1條外群序列運行程序確定重組序列的精確重組斷點。并按照重組位點將這些疑似鑲嵌片段從基因組上切割下來,與各個基因型參考序列的相應(yīng)片段建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹,以進化樹中鑲嵌片段與相應(yīng)基因型所有參考序列片段構(gòu)成獨立支系的自展支持率大于75%為標準,來確保重組事件的可信度。 結(jié)果 本次研究囊括了目前GenBank中已登記的所有來自中國包括香港、臺灣地區(qū)共計1642條人HBV全基因組序列,經(jīng)過片段分型法分析確定所有全基因組序列的基因型及基因型間重組。1642條HBV序列基因型的分型如下：A型8條(0.5%),B型634條(38.6%),C型935條(57.0%),D型30條(1.8%),I型35條(2.1%),未發(fā)現(xiàn)E-H4種基因型。5種基因型中,B基因型和C基因型為絕對優(yōu)勢基因型,所占比例高達95.6%,其中B基因型中全部為Ba亞型,未發(fā)現(xiàn)純B基因型,即Bj亞型。 本次分析檢測出755條HBV重組序列：B/C重組型676條,C/D重組型75條,A/C重組型3條,C/I重組型1條�？偣采婕�31種重組體,其中4種重組體為首次發(fā)現(xiàn),均為B/C重組型：BBBBCBBBCNBBB, CBCCBBBBCNBBB, CCCCCCCCCCCBC, CBCCNNBCCCCCC。所有來自中國地區(qū)的重組體均涉及C基因型的參與。 通過Simplot軟件分析,本次研究檢測出的31種重組體的代表序列的斷點位置均已精確定位。根據(jù)每種重組體的斷點位置對應(yīng)HBV全基因組形成的重組斷點分布情況,與既往報道的HBV基因重組的熱點區(qū)域基本一致。 結(jié)論 本文首次完成了對GenBank中已登記的所有來自中國地區(qū)的人HBV全基因組序列進行基因型間重組的檢測。本實驗運用片段分型法,以序列相似性原則為基礎(chǔ)的Blast搜索結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育進化分析,并利用Simplot軟件鑒定重組事件及斷點,適用于大規(guī)模的重組分析,降低計算量及時間成本。 HBV基因型因地理和種族的不同而在世界各地有著明顯的分布差異。在中國流行的基因型主要是A、B、C、D,其中C基因型為優(yōu)勢基因型,并主要分布在我國北方地區(qū),其次是B基因型,在南方地區(qū)較為普遍,而D基因型則局限于西北新疆地區(qū),較為少見,A基因型最為少見。這與本次實驗確定的基因型分布情況基本一致。 本文共檢測出755條重組全基因組序列,占全部1642條序列的46%。31種重組體中,71%(22/31)的重組體為B／C型,C/D型為16.1%(5/31),C/A型為9.7%(3/31),C/I型為3.2%(1/31)。有報道稱C基因型在HBV基因型間重組中具有較高頻率的傾向性,本次中國地區(qū)檢測出的重組體均有C基因型的參與符合這一特點,同時C基因型在中國地區(qū)的廣泛流行,與A、B、D、I基因型的混合感染發(fā)生率較高,進而涉及重組的機會可能增加。 634條B基因型序列全部經(jīng)鑒定為B/C重組型,由10種重組體組成。本次研究尚未發(fā)現(xiàn)純B基因型,即Bj亞型序列,而BBBBBBBBCNBBB重組體鑒定的624條序列全部都在前C/C區(qū)域與C基因型重組,可以歸類于分布亞洲的Ba亞型。另外9個屬于B基因型的重組體亦有重組片段覆蓋于前C/C基因區(qū)域,其中有7個B/C重組體出現(xiàn)了二次重組。由于本次在中國地區(qū)并未發(fā)現(xiàn)Bj亞型,因此出現(xiàn)二次重組的B/C重組體更有可能是流行于中國的Ba亞型與C基因型重組的結(jié)果,而非純B基因型與C基因型重組的結(jié)果。類似的情況也出現(xiàn)在本次研究檢測出的C/I重組體上,普遍認為I型是由A、C、G基因型疑似重組而形成的新興基因型,在此基礎(chǔ)上,I基因型和C基因型的混合感染可能導致C/I重組體的發(fā)生,并非只是C基因型的重組位點不同而一次重組形成的A/C/G重組體,這種推測還需更多類似重組序列的發(fā)現(xiàn)加以證實。 本次研究表明C/D重組體是中國地區(qū)僅次于B/C重組體的重組類型。西藏、青海及川西地區(qū)因其獨特的高原環(huán)境,種族上與流行D基因型的南亞印度等國比較接近,而甘肅、新疆是歷史上著名的絲綢之路的必經(jīng)地區(qū),連接歐亞大陸,同時作為維吾爾族和回族的聚居地,在種族上也與D基因型較為普遍的中亞各國更為接近。不同條件下與中國北方地區(qū)主要流行C基因型的漢族的融合可能導致了C/D重組體的不同特點。 本研究主要分析了GenBank中來自中國的人HBV基因組全長序列的重組體,總結(jié)了所有重組體的重組位點信息,為HBV的遺傳進化分析、重組機制的進一步的研究提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.62
【目錄】：

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