發(fā)布時(shí)間：2018-04-10 00:41

  本文選題：H.pylori　切入點(diǎn)：infection　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一種革蘭氏陰性螺旋桿菌,主要定植于人胃及十二指腸粘膜局部。與慢性胃炎、胃十二指潰瘍、胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤等疾病密切相關(guān)，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為Ⅰ類(lèi)致癌因子。研究表明，機(jī)體感染H.pylori后可產(chǎn)生一定程度的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但這種應(yīng)答并不能有效地清除病原體，反而造成H. pylori感染的慢性化，導(dǎo)致相關(guān)胃十二指腸疾病發(fā)生。雖然現(xiàn)在對(duì)H.pylori感染相關(guān)的免疫應(yīng)答機(jī)制研究日益深入，但目前的研究結(jié)果仍然不能完整詮釋H.pylori感染所產(chǎn)生的機(jī)體免疫應(yīng)答規(guī)律和感染慢性化后免疫損傷造成胃腸疾病發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制。因此，有必要對(duì)這一復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行更加廣泛而深入的探究。 眾所周知，關(guān)于H.pylori感染免疫應(yīng)答機(jī)制以往研究主要集中在Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞。然而，2008年，Nature Immunology雜志上兩篇研究相繼報(bào)道了一類(lèi)不同于TH1、Th2和Treg細(xì)胞的新Th細(xì)胞亞群，該亞群細(xì)胞的效應(yīng)因子以IL-9為主，被稱為T(mén)h9細(xì)胞。Th9新亞群的發(fā)現(xiàn)使得研究者不得不重新審視以往的Th亞群分類(lèi)以及相應(yīng)的免疫學(xué)功能，目前，關(guān)于Th9/IL-9的研究報(bào)道并不多見(jiàn)，主要集中于過(guò)敏性炎癥、自身免疫性疾病和寄生蟲(chóng)感染等。對(duì)于Th9細(xì)胞在病原體感染的免疫應(yīng)答作用以及在多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病中的免疫調(diào)控機(jī)制研究正逐漸開(kāi)展。然而，目前關(guān)于Th9在H.pylori感染中作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，在現(xiàn)有Th細(xì)胞亞群研究尚不能詮釋H.pylori感染的復(fù)雜應(yīng)答機(jī)制現(xiàn)狀下，，開(kāi)展Th9/IL-9相關(guān)免疫學(xué)研究將為深入認(rèn)識(shí)H.pylori自然感染和抗感染免疫機(jī)制提供新的線索和思路。 本課題選取野生型及IL-9敲除小鼠模型，研究H.pylori感染后小鼠胃黏膜組織中幽門(mén)螺桿菌定植量及相關(guān)細(xì)胞因子的變化情況，從而分析機(jī)體的免疫應(yīng)答情況。 目的： 通過(guò)檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染小鼠胃粘膜H. pylori定植量及相關(guān)細(xì)胞因子的水平變化情況，分析機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)。從而為研究H.pylori感染的免疫應(yīng)答機(jī)制提供新線索和思路。并為臨床應(yīng)用提供新的參考。 方法： 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 1.幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng) 復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)所用B0菌株（Balb/c小鼠H. pylori感染模型適應(yīng)株的初代分離菌），三線法接種于血平板中培養(yǎng)2d后洗脫細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)1d。調(diào)整細(xì)菌濃度為108CFU/ml，用于細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)。 2.小鼠細(xì)菌感染方式 將實(shí)驗(yàn)小鼠斷食水5h后，灌喂H. pylori菌液，0.3ml/只，1次/日，連續(xù)4天，灌喂H. pylori菌液1h后進(jìn)食水。對(duì)照組以PBS替代，其余處理相同。 3.小鼠胃粘膜H. pylori定植量檢測(cè) 于小鼠感染H. pylori后2周、4周時(shí)，提取小鼠胃粘膜DNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌16SrDNA。判斷Hp定植情況。 4.小鼠胃粘膜細(xì)胞因子RNA的檢測(cè) 于小鼠感染H. pylori后2周、4周時(shí)，提取小鼠胃粘膜組織總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃粘膜中IL-9,IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A及FoxP3+的RNA表達(dá)水平。 5.小鼠眼球血中IL-9表達(dá)量的檢測(cè) 于小鼠感染H. pylori后2周、4周時(shí)，采用ELISA法檢測(cè)小鼠眼球血中IL-9的表達(dá)量。 6.小鼠胃粘膜,IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A表達(dá)量的檢測(cè) 于小鼠感染H. pylori后2周、4周時(shí)，采用ELISA法檢測(cè)胃組織勻漿上清中IL-9,IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A的表達(dá)量。 7.小鼠胃粘膜組織炎癥程度分析 于小鼠感染H. pylori后2周、4周時(shí)，采用HE染色評(píng)價(jià)小鼠胃粘膜組織炎癥程度。 8.小鼠炎癥程度評(píng)分 胃黏膜炎癥分級(jí)積分參照Rauws分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):黏膜固有層炎癥細(xì)胞(單核細(xì)胞)浸潤(rùn)的密度(0～2分);黏膜固有層嗜中性多核粒細(xì)胞浸潤(rùn)的密度(0～3分);黏膜上皮內(nèi)嗜中性多核粒細(xì)胞的密度(0～3);淺表糜爛的程度(0～2分);對(duì)每個(gè)參數(shù),0是沒(méi)有,1分是輕度,2分是中度,3分是重度.應(yīng)用總積分0～10分的變化來(lái)衡量胃炎的程度。 9. H. pylori超聲抗原的制備及濃度測(cè)定 采用培養(yǎng)1天的B0菌株在超聲破碎儀下制備H. pylori超聲抗原，并用BCA法測(cè)定超聲上清中蛋白濃度。 10.數(shù)據(jù)分析 使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用非配對(duì)T檢驗(yàn)檢測(cè)胃粘膜H. pylori定植量。其它數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 體外實(shí)驗(yàn) 1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源：Hp感染后IL-9敲除和wt Balb/c小鼠的脾細(xì)胞，未處理組作為對(duì)照。 2. B細(xì)胞分離：用CD19+陽(yáng)選磁珠從H. pylori未感染的IL-9和wt balb/c小鼠脾細(xì)胞中分離出B cell做抗原提呈細(xì)胞。 3.抗原負(fù)載：1*106/孔APC負(fù)載/不負(fù)載H. pylori超聲上清抗原（終濃度10ug/ml）24孔板，24h，不完全1640洗2遍2000rad輻照。設(shè)平行對(duì)照孔3孔。 4. CD4+T細(xì)胞分離：用CD4+CD25+陽(yáng)選磁珠從H. pylori感染的IL-9和WT balb/c小鼠脾細(xì)胞中將CD4+CD25-TCell和CD4+CD25+TCell（Terg細(xì)胞）兩群細(xì)胞分選出來(lái)（純度90%-95%）。 5. APC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)：按照APC（2*105）:T cell（4*105）為1:2的比例將上面兩類(lèi)T cell加入到96孔平底板中孵育96h（細(xì)胞用以檢測(cè)增殖，48h及96h培養(yǎng)上清ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子（IFN-r、IL-17、IL-4、IL-10）的蛋白水平。96h后每孔加入1uCi of [3H]-thymidine，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)12-16h送西南醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)檢測(cè)T cell增殖情況。結(jié)果用刺激指數(shù)（SI）表示。SI=實(shí)驗(yàn)組cpm均值/對(duì)照組cpm均值。 6.數(shù)據(jù)分析 使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 1.感染H. pylori的野生型Balb/c小鼠在4周時(shí)，其胃粘膜組織幽門(mén)螺桿菌的定植量升高明顯。IL-9、IFN-γ、IL-17A及Foxp3+mRNA水平上升，IL-4及IL-10有上升趨勢(shì)但差異不明顯。IL-9、IFN-γ及IL-17A的蛋白表達(dá)量上升，而IL-4及IL-10的蛋白表達(dá)量變化不明顯。感染H. pylori的野生型Balb/c小鼠在4周時(shí)小鼠胃組織粘膜炎癥較未感染組嚴(yán)重。同時(shí)與2周及1周感染組相比炎癥也較重。 2.感染H. pylori的IL-9敲除小鼠在4周時(shí)，其胃粘膜組織幽門(mén)螺桿菌的定植量較野生型Balb/c小鼠升高。IL-17A及Foxp3+mRNA水平較野生型Balb/c小鼠下降，IFN-γ的mRNA水平上升明顯，IL-4及IL-10變化不明顯。IFN-γ蛋白表達(dá)量上升，IL-17A蛋白表達(dá)量下降明顯，IL-4及IL-10的蛋白表達(dá)量變化不明顯。感染H. pylori的IL-9敲除小鼠在4周時(shí)小鼠胃組織粘膜炎癥較野生型Balb/c，小鼠嚴(yán)重。且兩組感染組也較未感染組的炎癥重。 3.在感染H. pylori的同時(shí)將重組小鼠IL-9細(xì)胞因子回注到IL-9敲除小鼠體內(nèi)，在4周時(shí)，回注IL-9組小鼠胃粘膜組織幽門(mén)螺桿菌的定植量較對(duì)照組顯著降低。IL-17A的mRNA水平較對(duì)照組上升，IFN-γ的mRNA水平下降明顯，IL-4、IL-10及Foxp3+在各組間變化不明顯；IL-17A的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上升，IFN-γ蛋白表達(dá)量則下降，IL-4及IL-10的蛋白表達(dá)量變化不明顯。在感染H. pylori的同時(shí)將重組小鼠IL-9細(xì)胞因子回注到IL-9敲除小鼠體內(nèi)，在4周時(shí)，回注IL-9組小鼠胃粘膜組織幽門(mén)螺桿菌的炎癥程度較對(duì)照組減輕。 4.在感染H. pylori的同時(shí)將重組小鼠IL-9細(xì)胞因子回注到野生型Balb/c小鼠體內(nèi)，在4周時(shí)，回注IL-9組小鼠胃粘膜組織幽門(mén)螺桿菌的定植量較對(duì)照組降低。IL-17A及IL-10的mRNA水平較對(duì)照組上升，IFN-γ的mRNA水平下降。IL-4及Foxp3+的mRNA水平則無(wú)明顯變化�；刈L-9組小鼠胃粘膜組織中IL-17A及IL-10的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上升，IFN-γ的蛋白表達(dá)量則下降。IL-4的蛋白表達(dá)量在4周時(shí)變化不明顯。在感染H. pylori的同時(shí)將重組小鼠IL-9細(xì)胞因子回注到野生型Balb/c小鼠體內(nèi)，在4周時(shí)，回注IL-9組小鼠胃粘膜組織幽門(mén)螺桿菌的炎癥程度較對(duì)照組減輕。 體外實(shí)驗(yàn) 1.感染H. pylori的野生型Balb/c小鼠和IL-9敲除小鼠脾細(xì)胞中分離出的CD4+CD25-TCells及CD4+CD25+TCells經(jīng)H. pylori抗原刺激后野生型Balb/c小鼠脾細(xì)胞中的CD4+CD25-TCells的增殖能力較IL-9敲除小鼠增強(qiáng)。 2.感染H. pylori的野生型小鼠脾細(xì)胞中分離出的CD4+CD25-TCell細(xì)胞經(jīng)H.pylori抗原刺激后其培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量較IL-9敲除小鼠高，IFN-γ的表達(dá)量較IL-9敲除小鼠低，IL-4及IL-10未見(jiàn)明顯變化。 結(jié)論： 1.針對(duì)臨床上H.pylori感染所產(chǎn)生的機(jī)體免疫應(yīng)答規(guī)律和感染慢性化后免疫損傷造成胃腸疾病發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制，首次從IL-9應(yīng)答角度探討H.pylori自然感染的作用機(jī)制。 2.采用不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（野生型Balb/c小鼠，IL-9KO小鼠，rIL-9回注IL-9KO小鼠及rIL-9回注野生型Balb/c小鼠）證實(shí)IL-9通過(guò)促進(jìn)IL-17A的表達(dá)及降低IFN-γ的表達(dá)對(duì)H.pylori的感染起保護(hù)性作用。 3.成功分離IL-9KO小鼠和野生型Balb/c小鼠脾細(xì)胞中的CD4+CD25-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-9KO小鼠的CD4+CD25-T細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ而低表達(dá)IL-17A，此結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，再次證實(shí)IL-9通過(guò)促進(jìn)IL-17A的表達(dá)及降低IFN-γ的表達(dá)對(duì)H.pylori的感染起保護(hù)性作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R573

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本文編號(hào)：1728928