本文選題：四氯化碳　切入點：肝纖維化　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:肝纖維化是慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積和代謝失衡的結(jié)果。盡管肝纖維化的發(fā)生機(jī)制的闡明已經(jīng)取得了重大進(jìn)展,但仍然缺乏有效的抗肝纖維化策略。然而中藥在抗肝纖維化治療中具有多層次、多途徑、多靶點的綜合作用,我們的自擬益氣活血方是由黃芪、丹參、云苓、郁金、白豆蔻等中藥組成,具有“益氣活血,疏肝健脾”之功效,有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可抑制細(xì)胞過度自噬從而發(fā)揮對受損細(xì)胞的保護(hù)作用。自噬(autophagy)是一些有缺陷的細(xì)胞器和未折疊蛋白被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后,送入溶酶體中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用從而維持細(xì)胞內(nèi)平衡的代謝過程。近年研究發(fā)現(xiàn),自噬能通過降解脂滴為肝星狀細(xì)胞活化提供能量,并影響肝星狀細(xì)胞的增殖及膠原纖維的產(chǎn)生,但自噬在肝纖維化中的作用以及益氣活血方對自噬的調(diào)控作用及分子機(jī)制尚不清楚。本研究以CCl4誘導(dǎo)Wistar大鼠肝纖維化模型,以扶正化瘀復(fù)方為陽性對照,應(yīng)用益氣活血方進(jìn)行治療研究,明確益氣活血方能否有效逆轉(zhuǎn)/延緩肝纖維化進(jìn)展,并進(jìn)一步探明肝臟細(xì)胞自噬與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以及益氣活血方是否可通過肝臟細(xì)胞自噬阻止肝纖維化進(jìn)展,為肝纖維化的防治提供新的策略及科學(xué)依據(jù)。方法:選用健康雄性Wistar大鼠,并隨機(jī)分為4組進(jìn)行實驗研究,模型組:采用30%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)腹腔注射建立肝纖維化模型;益氣活血方干預(yù)組:CCl4腹腔注射聯(lián)合益氣活血沖劑灌胃;扶正化瘀方干預(yù)組:CCl4腹腔注射聯(lián)合扶正化瘀復(fù)方灌胃;對照組:等體積橄欖油代替CCl4及等體積的生理鹽水代替益氣活血沖劑灌胃,均喂養(yǎng)8周,水合氯醛麻醉下處死動物,留取血清標(biāo)本;肝組織部分采用4%中性甲醛溶液固定,備行肝組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)分析,其余肝組織液氮快速冷凍后儲存于-80℃冰箱,以備蛋白及m RNA檢測。1實驗大鼠一般情況:觀察大鼠活動力、毛發(fā)、進(jìn)食及存活情況。2血清生化學(xué)變化:采用全自動生化分析儀、酶法測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,AST)水平。3肝組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察:4%中性甲醛溶液固定肝組織標(biāo)本,經(jīng)石蠟包埋,行5μm組織切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson三色染色觀察肝臟炎癥及纖維化程度;采用免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型膠原α1鏈(alpha-1 type I collagen,Col1A1)的表達(dá),應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析,每張切片隨機(jī)選取10個視野(200×),測定α-SMA及Col1A1表達(dá)的累積光密度(integrated optical density,IOD)。4肝臟細(xì)胞自噬及纖維化相關(guān)基因表達(dá)檢測:采用-80o C冰箱儲存肝組織標(biāo)本,分別提取蛋白和RNA,實時定量PCR及Western blot檢測肝纖維化相關(guān)基因α-SMA和Col1A1的表達(dá)及自噬相關(guān)因子自噬蛋白7(Autophagy-related gene 7,Atg7)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)及泛素結(jié)合蛋白(SQSTM1/p62)的表達(dá)。采用Image J分析系統(tǒng)軟件分析Western blot電泳條帶灰度值,計算蛋白相對表達(dá)量。5統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組間比較均采用單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1實驗動物一般情況:對照組大鼠全部存活,精神飽滿,活潑好動,毛發(fā)有光澤,攝食、飲水正常;模型組大鼠存活6只,精神萎靡,活動遲緩無力,毛發(fā)無光澤,攝食及飲水均明顯減少,造模過程中6只動物死亡;益氣活血及扶正化瘀中藥干預(yù)組分別有6只大鼠存活,精神可,活動自如,毛發(fā)略有光澤,攝食、飲水可,二組各有3只動物死亡。2 ALT、AST檢測:分別檢測對照組、CCl4肝纖維化模型組、益氣活血方干預(yù)組和扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組大鼠血清ALT、AST水平,結(jié)果顯示CCl4肝纖維化模型組大鼠血清ALT、AST水平較對照組顯著升高,依次為106.80±18.24 vs 38.17±4.99,278.40±66.14 vs 121.00±11.87,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001);益氣活血方干預(yù)組大鼠血清ALT、AST水平較CCl4肝纖維化模型組顯著降低,依次為66.80±10.42,122.60±16.65,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001);扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組大鼠血清ALT、AST水平較CCl4肝纖維化模型組也有所改善,依次為73.20±10.33,125.4±16.92,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。3肝組織病理學(xué)變化:對照組肝小葉結(jié)構(gòu)均正常,肝索排列整齊,肝板以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列;CCl4肝纖維化模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,可見點、灶狀肝細(xì)胞壞死及竇周纖維化,匯管區(qū)纖維組織增生,纖維間隔形成(S5.64±0.22,vs對照組,P0.01);益氣活血方干預(yù)組肝纖維化程度較CCl4肝纖維化模型組明顯減輕(S3.70±0.35,vs模型組,P0.01);扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組肝組織纖維化程度亦較模型組好轉(zhuǎn)(S3.9±0.34,vs模型組,P0.01)。4肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3B和p62 m RNA表達(dá):CCl4肝纖維化模型組大鼠肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B m RNA表達(dá)較對照組均顯著上調(diào),p62下降,依次為0.88±0.13 vs 0.19±0.07,0.99±0.075vs 0.05±0.024,1.11±0.12 vs 0.33±0.07,0.92±0.072 vs 0.32±0.02,1.16±0.17vs 3.18±0.18,P0.001;與CCl4肝纖維化模型組相比,益氣活血方干預(yù)組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B m RNA表達(dá)明顯降低,p62上升依次為0.34±0.05,0.32±0.09,0.66±0.08,0.66±0.07,1.79±0.09,P0.01;扶正化瘀干預(yù)組肝組織與CCl4肝纖維化模型組相比α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B m RNA表達(dá)明顯降低,p62略上升依次為0.48±0.043,0.31±0.11,0.74±0.07,0.58±0.03,1.45±0.03,P0.05。5肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3BII和p62蛋白表達(dá):CCl4肝纖維化模型組大鼠肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值較對照組均顯著增加,為34675.09±1200.29 vs 10360.13±1442.25,22480.85±1035.92 vs2915.58±574.99,P0.001;與CCl4肝纖維化模型組相比,益氣活血方干預(yù)組肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值均明顯下降,分別為22051.47±1610.70、12565.8±932.23,P0.001;扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組與CCl4肝纖維化模型組相比肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值亦明顯下降,分別為22556.52±1510.60、12997.9±903.85,P0.001;CCl4肝纖維化模型組小鼠肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達(dá)較對照組均顯著增強(qiáng),依次為0.83±0.05 vs 0.05±0.006,0.73±0.002 vs 0.29±0.02,0.12±0.002 vs 0.06±0.002,0.83±0.024 vs 0.53±0.02,P0.001;益氣活血方干預(yù)組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達(dá)明顯降低,依次為0.19±0.02,0.35±0.003,0.10±0.002,0.67±0.02,P0.001;扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達(dá)也明顯降低,依次為0.31±0.02,0.47±0.003,0.10±0.003,0.62±0.03,P0.001;CCl4肝纖維化模型組小鼠肝組織p62蛋白表達(dá)較對照組均顯著降低,為0.26±0.02 vs 0.68±0.03,P0.001;益氣活血方和扶正化瘀方干預(yù)組肝組織p62蛋白表達(dá)均明顯改善,分別為0.45±0.02,0.35±0.04,P0.001。結(jié)論:1肝臟細(xì)胞自噬可能為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一,自噬相關(guān)基因Atg7、LC3BII及p62表達(dá)在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。2益氣活血方與扶正化瘀方均可通過抑制肝臟細(xì)胞自噬,調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化、細(xì)胞間基質(zhì)的分泌與沉積,進(jìn)而阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化。3益氣活血方重在益氣健脾、活血行瘀,在改善肝臟理化指標(biāo)的基礎(chǔ)上,可多靶點發(fā)揮抗肝纖維化作用,有望成為治療肝纖維化、肝硬化的新型中藥方劑。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1728445