本文選題：慢性乙型肝炎　切入點：組織學肝硬化　出處：《大連醫(yī)科大學》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的:肝纖維化是由致病因子引起的肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生,肝內(nèi)細胞外基質(zhì)彌漫性沉積過度的病理過程。肝纖維化的形成是由于機體感染病毒時,引起肝臟炎癥反應的同時,激活了肝臟的免疫系統(tǒng)修復組織,修復的過程過度或者失控時,導致肝功能異常和肝臟結(jié)構(gòu)的改變。輕者為肝纖維化,嚴重者造成肝小葉的結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂,逐步形成假小葉,最終演變?yōu)楦斡不�。大量的臨床研究結(jié)果表明[1],人體自身內(nèi)部存在纖維降解系統(tǒng),該系統(tǒng)可以使肝纖維化實現(xiàn)逆轉(zhuǎn),甚至早期的肝硬化也可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)[2][3],而肝組織損壞嚴重的失代償期肝硬化則不能逆轉(zhuǎn)。因此,早期診斷和治療肝纖維化,就可以阻止肝纖維化向肝硬化的方向進展,這對于改善慢性肝病患者的預后有著極其重要的意義。早期的肝纖維化的血清標志物主要反映肝臟膠原的合成和分解代謝的動態(tài)變化,不能真正反映膠原蛋白的沉積程度。目前公認的肝纖維化診斷“金標準”是肝臟穿刺病理學檢查。由于該檢查具有創(chuàng)傷性及局限性,并且患者要忍受一定的痛苦,重復檢查的可能性較小,因此其臨床應用受到限制。影像學檢查對重度肝纖維化診斷比較可靠,而對輕、中度肝纖維化的診斷則缺乏特異性。目前臨床缺乏評價肝纖維化程度[4]的實用的血清標志物,所以,找出早期診斷肝纖維化、評價肝纖維化程度的血清標志物來指導臨床的診治是當前醫(yī)學的一項重要研究課題。代謝組學(metabonomics/metabolomics)是主要研究生物被擾動后所產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的種類、數(shù)量以及其中變化規(guī)律的一門科學。代謝組學已被應用到肝衰竭[5]、非酒精性脂肪肝[6]、原發(fā)性肝癌[7][8]、藥物和毒物等非病毒性因素引起的肝臟損傷[9][10]等的早期標志物標志物篩查中,為疾病的早期診斷和治療提供了新的方法。本實驗采用高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)(uplc/ltq-orbitrapms)技術(shù)來分離并提取慢性乙型肝炎、代償期肝硬化以及失代償期肝硬化患者血清中的代謝產(chǎn)物,以期發(fā)現(xiàn)肝纖維化的代謝產(chǎn)物標志物群。方法:1.隨機選取2011年10月-2013年9月于煙臺市傳染病醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者34例,所有患者均接受了肝穿刺病理檢查,隨機選取于大連市第六人民醫(yī)院住院治療的失代償期肝硬化患者15例。同期選擇20例健康志愿者作為正常對照組,肝功正常、病原學檢查陰性。所有入組人員在知情同意的前提下,留取空腹血4ml,半小時內(nèi)將血清分離,留取血清,-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。2.高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(uplc/ltq-orbitrapms)技術(shù)檢測所有患者血清中的代謝產(chǎn)物。2.1樣品準備:室溫下靜置解凍血清,取100ul血清加400ul甲醇除蛋白,渦旋60秒,13000rpm離心15分鐘,取上清液400ul置冷凍濃縮儀凍干。2.2超高效液相色譜分析:采用超高效液相色譜分析儀。沖洗柱采用10cm×2.1mm×1.7umc18柱根據(jù)梯度不同而改變的乙腈溶液沖洗,根據(jù)物質(zhì)在柱內(nèi)停留時間的長短,完成各種代謝產(chǎn)物的分離。2.3高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(uplc/ltq-orbitrapms):通過采用ltq-orbitrap質(zhì)譜分析儀,對已經(jīng)分離的代謝產(chǎn)物實行esi+模式操作。2.4處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學分析:通過micromassmarkerlynx獲取每峰停留時間(tr)和m/z數(shù)據(jù)對,標準化輸出每峰離子密度后,進行主成分分析(pca)。根據(jù)非參檢驗結(jié)果,尋找差異比較大的代謝產(chǎn)物。spss.18進行統(tǒng)計學分析。2.5確定代謝產(chǎn)物名稱:根據(jù)精確分子量來分析、研究確定代謝產(chǎn)物名稱。結(jié)果:1.對慢性乙型肝炎34例進行肝臟穿刺進行病理檢查,結(jié)果顯示:s1:8例,s2:5例,s3:1例,s4:20例。其中s1-s3期14例,為慢性乙型肝炎組;s4期20例,為早期肝硬化組即代償期肝硬化組。2.在對正常對照組、慢性乙型肝炎組、代償期肝硬化組、失代償期肝硬化組患者血清物質(zhì)代謝譜的比較中發(fā)現(xiàn),相對正常對照組,慢性乙型肝炎、代償期肝硬化、失代償期肝硬化患者蛋氨酸呈逐漸下降趨勢,輔酶Q1、羧乙基精氨酸、甘氨脫氧膽酸呈逐漸上升趨勢。結(jié)論:蛋氨酸(Methionine)、輔酶Q1(coenzyme Q1)、羧乙基精氨酸(octopine)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)可作為肝纖維化的代謝標志物群。
[Abstract]:Background and objective: hepatic fibrosis is abnormal hyperplasia of connective tissue caused by pathogenic factor in the liver, the deposition of the pathological process of excessive extracellular matrix diffuse liver. Hepatic fibrosis is due to infection when the virus causes inflammation of the liver and activate the immune system of the liver tissue repair, the repair process of excessive or out of control, leading to abnormal liver function and liver structure changes. The light of hepatic fibrosis, hepatic lobule structure causing serious disorder, gradually formed pseudolobule, eventually evolved into cirrhosis. Results many clinical studies showed that [1], fiber degradation system of the human body itself exists, the system can make the realization of hepatic fibrosis reversal even early cirrhosis may also be reversed [2][3], and liver tissue damage serious decompensated hepatic cirrhosis is irreversible. Therefore, early diagnosis and treatment Hepatic fibrosis, can prevent the progress of liver fibrosis to cirrhosis, which is of great significance to improve the prognosis of patients with chronic liver disease. The serum markers of liver fibrosis in the early stage mainly reflects the dynamic changes of liver collagen synthesis and catabolism, can not truly reflect the degree of collagen deposition. The hepatic fibrosis diagnosis "recognized the gold standard is the pathological examination. The examination is traumatic and limitations, and patients suffer some pain, less likely to repeat the inspection, so its clinical application is restricted. Imaging examination in the diagnosis of severe liver fibrosis is reliable, and the light, moderate liver fibrosis is the lack of diagnosis the lack of specificity. The clinical utility of serum markers to evaluate the degree of liver fibrosis, [4] so, find out the early diagnosis of liver fibrosis, liver fibrosis evaluation The level of serum markers to guide the clinical diagnosis and treatment is an important subject in current medicine. Metabonomics (metabonomics/metabolomics) is a kind of metabolites produced by biological research after disturbance, a number of science and which changes in the law. Metabonomics has been applied to non alcoholic liver failure [5] fatty liver [6], hepatocellular carcinoma [7][8], caused by drugs and poisons and other non viral factors of liver injury [9][10] markers for early screening biomarkers, which provides a new method for early diagnosis and treatment of diseases. This experiment using high performance liquid chromatography - mass ion trap mass spectrometry (mass uplc/ltq-orbitrapms) technology to separate and extract the chronic hepatitis B, cirrhosis and decompensated serum metabolites in patients with liver cirrhosis, in order to find the metabolites of liver fibrosis markers. Method: 34 patients with chronic hepatitis B were randomly selected from the 1. October 2011 -2013 year in September to visit Yantai city hospital for infectious disease patients, all patients underwent liver biopsy, randomly selected from the Sixth People's Hospital of Dalian city hospital treatment of patients with decompensated liver cirrhosis in 15 cases. In the same period 20 cases of healthy volunteers as normal control group, normal liver function, pathogenic examination negative. All groups in the premise of informed consent, collected fasting blood 4ml, serum separation within half an hour, the serum -80, C refrigerator cryopreservation inspection equipment.2. high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometry with orbit (uplc/ltq-orbitrapms) technique for the detection of metabolites all samples of.2.1 in the serum of patients with preparation: room temperature static thawing serum 100ul, serum 400ul and methanol deproteinization, vortex 13000rpm centrifugal 60 seconds, 15 minutes, the supernatant was 400ul the frozen freeze concentration instrument .2.2 ultra high performance liquid chromatography using ultra performance liquid chromatography analyzer. Rinse the acetonitrile solution column using 10cm * 2.1mm * 1.7umc18 column is changed according to the different gradient washing, according to the residence time of material in the column length, to complete a variety of metabolites of.2.3 separation by high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometry track mass spectrometry (uplc/ltq-orbitrapms) by using ltq-orbitrap mass spectrometry analysis and statistical data, the operation of the.2.4 processing mode of esi+ metabolites have been isolated: obtaining each peak retention time by micromassmarkerlynx (TR) and m/z data to standard output, each peak ion density, principal component analysis (PCA) based on non parametric test. The search for the difference of metabolic products of.Spss.18 were analyzed to determine the.2.5 metabolic product name: according to the accurate molecular weight analysis, determination of metabolites Name. Results: 1. of 34 cases of chronic hepatitis B liver puncture biopsy, the results showed that: s1:8 cases, s2:5 cases, s3:1 cases, s4:20 cases. 14 cases of S1-S3 patients and chronic hepatitis B group; 20 cases of stage S4, early cirrhosis group decompensated cirrhosis group.2. in normal control group, chronic hepatitis group, cirrhosis group, found in decompensated cirrhosis group serum substance in patients with metabolic spectrum comparison, relative to the normal control group, chronic hepatitis B, cirrhosis, decompensated cirrhosis patients with loss of methionine decreased gradually, coenzyme Q1, octopine, glycodeoxycholate increased. Conclusion: methionine (Methionine), coenzyme Q1 (coenzyme Q1), carboxyethyl arginine (octopine) and glycodeoxycholate (GDCA) can be used as a metabolic marker of liver fibrosis group.

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62;R575.2

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本文編號：1712712