本文選題：HCV　切入點(diǎn)：NS2　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）于1989年被Choo等發(fā)現(xiàn)，到目前為止，全球約有1.7億人感染，占世界人口的2～3%。我國(guó)也是丙型肝炎高發(fā)區(qū)，健康人群中抗HCV陽(yáng)性率為3.2%。HCV感染的慢性化率較高，由此增加了發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma, HCC）及其他相關(guān)致死性肝病的風(fēng)險(xiǎn)。 丙型肝炎病毒(HCV)屬黃病毒科，基因組為單股正鏈RNA，含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)多聚蛋白前體，后者在病毒自身蛋白酶和宿主蛋白酶的作用下被切割為結(jié)構(gòu)蛋白core、E1、E2、p7，和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B一共10種病毒蛋白。作為連接HCV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白關(guān)鍵部分的NS2蛋白一直是研究的熱點(diǎn)，其氨基端依賴于宿主信號(hào)肽切割，羧基端則由NS2-NS3蛋白酶催化自身切割與NS3分離而釋放。釋放出的具有功能的NS2蛋白為病毒感染細(xì)胞所必需，還可參與調(diào)控宿主細(xì)胞的增殖和基因表達(dá)。Erdtmann等發(fā)現(xiàn)NS2與肝臟特異的促凋亡因子CIDE-B(celldeath-inducing DFFA-like effector B)相互作用，抑制CIDE-B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。NS2還可抑制IFN-β基因啟動(dòng)子的活性，從而阻止宿主體內(nèi)信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究應(yīng)用HCV2a型JFH-1株基因?yàn)槟０�，�?gòu)建了HCV NS2真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株L02，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆株，從對(duì)L02增殖水平及所分泌細(xì)胞因子的影響角度了解NS2對(duì)宿主細(xì)胞的作用。 肝臟中存在枯否氏細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）、NK細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，它們?cè)跈C(jī)體抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用，但多個(gè)研究表明，HCV在肝臟微環(huán)境中可通過(guò)自身蛋白干擾免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制免疫應(yīng)答，有利于持續(xù)存在于宿主體內(nèi)。本研究通過(guò)應(yīng)用transwell小室將轉(zhuǎn)染NS2基因的L02細(xì)胞與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，從不同水平檢測(cè)巨噬細(xì)胞變化，旨在研究HCV NS2蛋白、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞三者在肝臟微環(huán)境中的相互作用，以期為以HCV為基礎(chǔ)的肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制和HCV免疫逃逸研究提供新的視角。 方法： 1從JFH-1株(HCV2a)全長(zhǎng)基因質(zhì)粒上通過(guò)PCR方法擴(kuò)增HCV NS2基因,連接至pMD18-T載體，測(cè)序正確后，經(jīng)BamHI、HindⅢ雙酶切，將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖電泳鑒定并測(cè)序。 2分別提取及純化pEGFP-C1-vector和pEGFP-C1-NS2質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株L02并G418藥物篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP蛋白熒光強(qiáng)度，提取細(xì)胞總RNA后PCR檢測(cè)目的基因GFP-NS2，提取細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測(cè)GFP-NS2融合蛋白的表達(dá)以鑒定。 3體外培養(yǎng)L02、L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化計(jì)數(shù)后接種于96孔板（1×104個(gè)/孔），分別于培養(yǎng)24h，48h，72h時(shí)，每孔加入MTS溶液20μl，37℃培養(yǎng)箱孵育4h，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的吸光度值,MTS法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化。 4體外培養(yǎng)L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化計(jì)數(shù)后接種于6孔板（1×106個(gè)/孔），24h后提取細(xì)胞總RNA，Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子（IL-8、IL-10、TGF-β）mRNA水平變化。 5將L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞THP1共培養(yǎng)，并設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞THP1為對(duì)照。于共培養(yǎng)6h、10h后，收取巨噬細(xì)胞THP1提取總RNA，Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子（IL-1β、IL-8、IL-10、TGF-β）mRNA水平變化；于共培養(yǎng)12h、24h后，取巨噬細(xì)胞THP1上清，使用CBA Human Inflammatory CytokinesKit檢測(cè)巨噬細(xì)胞THP1分泌的炎性細(xì)胞因子的變化；于共培養(yǎng)12h、24h后，收取巨噬細(xì)胞THP1提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT3、磷酸化STAT3的活性。 結(jié)果： 1成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定有約650bp大小片段存在，測(cè)序結(jié)果顯示與Genbank記載序列一致。 2獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。經(jīng)PCR檢測(cè)L02(pEGFP-C1-NS2)組中有目的基因GFP-NS2的表達(dá)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示有GFP-NS2融合蛋白的表達(dá)。 3L02細(xì)胞增殖曲線顯示，L02細(xì)胞組、L02(pEGFP-C1-vector)細(xì)胞組和L02(pEGFP-C1-NS2)細(xì)胞組，三組細(xì)胞之間增殖水平無(wú)差別（P0.05）。 4L02細(xì)胞Real-timePCR結(jié)果顯示：L02(pEGFP-C1-NS2)細(xì)胞組抑炎因子IL-10、TGF-βmRNA水平較L02細(xì)胞組和L02(pEGFP-C1-vector)細(xì)胞組升高（P0.05）;與L02組比較， L02(pEGFP-C1-vector)細(xì)胞組和L02(pEGFP-C1-NS2)細(xì)胞組促炎因子IL-8mRNA表達(dá)水平降低，但轉(zhuǎn)質(zhì)粒兩組間無(wú)差異（P0.05）。 5THP1細(xì)胞Real-timePCR結(jié)果顯示，與L02(pEGFP-C1-NS2)共培養(yǎng)6h后THP1細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、TGF-β mRNA水平高于其他三個(gè)對(duì)照組（P0.05）細(xì)胞因子IL-10在四組之間無(wú)差異（P0.05）；而在共培養(yǎng)10h后，與L02(pEGFP-C1-NS2)共培養(yǎng)的THP1細(xì)胞中IL-10mRNA水平高于其他三個(gè)對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 6CBA結(jié)果顯示，，THP1與L02(pEGFP-C1-NS2)共培養(yǎng)12h、24h后其上清中細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF、IL-10均顯著高于其他三個(gè)對(duì)照組（P0.05）。 7L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞THP1共培養(yǎng)12h、24h后，提取巨噬細(xì)胞THP1蛋白，western blot顯示STAT3總量及磷酸化STAT3表達(dá)無(wú)明顯改變。 結(jié)論： 1成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。 2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV NS2的L02細(xì)胞抑炎因子IL-10和TGF-βmRNA表達(dá)增高。 3與轉(zhuǎn)染HCV NS2基因的L02細(xì)胞共培養(yǎng)，可促巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和負(fù)調(diào)節(jié)因子IL-10、TGF-β在mRNA水平或蛋白水平表達(dá)增高。
[Abstract]:Objective : Hepatitis C virus ( HCV ) was detected by Choo et al . in 1989 . So far , about 170 million people worldwide have been infected , accounting for 2 - 3 % of the world ' s population . In China , the positive rate of HCV infection is 3.2 % . The chronic rate of HCV infection is high , thereby increasing the risk of developing liver fibrosis , liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma ( HCC ) and other related fatal liver diseases .

Hepatitis C virus ( HCV ) belongs to Flaviviridae , the genome of which is a single strand of positive strand RNA , and contains an open reading frame , which encodes a multimeric precursor which is cleaved into structural protein core , E1 , E2 , p7 , and non - structural protein NS , NS3 , NS4A , NS4B , NS5A and NS5B under the action of virus autoprotease and host protease .

In this study , we use transwell small cell to co - culture L02 cell transfected with NS gene with human macrophage to study the interaction between HCV NS3 protein , liver cell and macrophage in the microenvironment of liver , and to provide a new perspective for the research of HCV - based HCC pathogenesis and HCV immune escape study .

Method :

1 From JFH - 1 ( HCV2a ) full - length gene plasmid , the gene was amplified by PCR and ligated to pMD18 - T vector . After the sequencing was correct , the recombinant eukaryotic expression plasmid was cloned into the eukaryotic expression plasmid , and then the recombinant eukaryotic expression plasmid was constructed by agarose gel electrophoresis and sequencing .

2 . The expression of GFP - 2 fusion protein was determined by Western blot .

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本文編號(hào)：1708621