本文選題：炎癥性腸病　切入點(diǎn)：ATG16L1　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)與克羅恩病(Crohn's Disease,CD)共稱炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),是一種病因不明的腸道慢性炎癥性疾病。我國近年UC呈高發(fā)趨勢,最近10年報(bào)告的病例數(shù)目是10年前的3.8倍。然而,由于UC發(fā)病機(jī)制不明,目前尚無有效的預(yù)防復(fù)發(fā)方法,所以該病已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾病之一。因此,研究UC發(fā)生機(jī)制并探索有效防治措施已成為該領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。自噬(Autophage)是一個散裝降解系統(tǒng),胞漿成分被雙層膜囊泡包裹進(jìn)而有針對性與溶酶體融合降解,是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)。細(xì)胞自噬在饑餓或各種壓力狀態(tài)下,胞質(zhì)中可溶性蛋白和部分細(xì)胞器被降解成氨基酸等用于供能和生物合成,這是真核細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中形成的一種自我保護(hù)機(jī)制。另外,細(xì)胞自噬具有持家功能,清除變性或錯誤折疊的蛋白質(zhì)、衰老或損傷的細(xì)胞器等,這有利于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。近年來許多研究表明,細(xì)胞自噬與個體發(fā)育、氧化性損傷保護(hù)、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤增殖及免疫炎癥性疾病有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的病原體被自噬溶酶體降解,是公認(rèn)的抗菌防御機(jī)制。到目前為止,已經(jīng)確定了200多個UC的易感位點(diǎn)。一些基因位點(diǎn),是UC獨(dú)特的,而有些基因位點(diǎn)是與其他疾病共享的,這充分表明了UC病理生理的復(fù)雜性。以前的研究發(fā)現(xiàn),自噬的一個組成部分Atg5在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞固有免疫反應(yīng)中的重要性,研究顯示Atg5在活動性肺結(jié)核和肺部炎癥中起著保護(hù)性作用。而對自噬基因ATG16L1的研究甚少。最近研究表明,自噬基因ATG16L1遺傳變異性與UC密切相關(guān),成為UC發(fā)病機(jī)制的研究重點(diǎn)。體外研究實(shí)驗(yàn)表明,CD相關(guān)ATG16L1的T300A單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism,SNP)是一個功能喪失的SNP,通過增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)介導(dǎo)的對ATG16L1蛋白的裂解,從而影響自噬的功能。另外,Lassen等把人ATG16L1T300A基因敲入到小鼠體內(nèi),更好地闡明了ATG16L1T300A的作用。結(jié)果顯示,與野生型(Wild type,WT)小鼠相比,ATG16L1的T300A基因敲入小鼠的潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的形態(tài)異常和功能缺陷,抗菌肽的分泌減少和IL-1b的分泌增加,表現(xiàn)為惡化的鼠傷寒沙門氏桿菌感染的盲腸炎癥。另一組研究結(jié)果也表明了,在人ATG16L1T300A和小鼠ATG16L1T316A(相當(dāng)于人的T300A)原代巨噬細(xì)胞中,與WT巨噬細(xì)胞相比,自噬功能減低和炎癥因子IL-1b的分泌量明顯增加。為了更好地了解自噬的細(xì)胞特異性作用,Conway等建立了ATG16L1條件性敲除小鼠(腸上皮細(xì)胞或CD11C+樹突狀細(xì)胞特異性敲除ATG16L1)。與野生型小鼠相比,上皮細(xì)胞Atg16L1缺陷的小鼠表現(xiàn)出潘氏細(xì)胞的異常,更易感染鼠傷寒鼠傷寒沙門氏桿菌的感染。而CD11C+樹突狀細(xì)胞Atg16L1缺陷的小鼠表型與WT小鼠的表型相似。這些結(jié)果說明,腸上皮細(xì)胞的ATG16L1在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,但CD11C+樹突狀細(xì)胞的ATG16L1的作用可能是可有可無的。因此,本研究的目的是闡明ATG16L1在樹突狀細(xì)胞中,特別是在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠樹突狀細(xì)胞中的作用。所以,在本研究中,獨(dú)立的產(chǎn)生了樹突狀細(xì)胞特異性Atg16L1敲除的小鼠,建立了兩種急性結(jié)腸炎(鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性結(jié)腸炎模型和3%DSS急性結(jié)腸炎模型)和一種慢性結(jié)腸炎模型(2.5%DSS慢性結(jié)腸炎模型),采用細(xì)胞流式術(shù)、免疫熒光染色、透射電鏡、Western blot方法、間接酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的檢測、細(xì)菌吞噬試驗(yàn)、慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)及real-time Q-PCR等技術(shù)檢測Atg16L1敲除的小鼠原代樹突狀細(xì)胞的功能,以此來表明樹突狀細(xì)胞的自噬作用在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能,為研究其與本病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,為探討UC的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。具體實(shí)驗(yàn)分為以下三部分:第一部分:ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的成功建立目的:確定ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的成功建立。方法:1)ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的建立是與gen Oway公司合作完成的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則,ATG16L1基因的外顯子3被選中敲除;在ATG16L1基因的外顯子3兩側(cè)各放一個Lox P序列和新霉素序列,新霉素陽性的細(xì)胞即為選擇的特異性樹突狀細(xì)胞;將帶有新霉素序列的小鼠后代再與帶有Flp序列的小鼠交配,將新霉素序列切除掉,即得到ATG16L1f/f小鼠;ATG16L1f/f小鼠與帶有Cre的小鼠交配,后代通過PCR檢測flox與Cre基因即可得到ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠。2)應(yīng)用Q-PCR技術(shù)分別檢測了ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的ATG16L1基因。結(jié)果:1)應(yīng)用Cre/Lox P技術(shù)成功建立了ATG16L1f/f小鼠和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠。2)Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠中無ATG16L1基因的表達(dá)。第二部分:樹突狀細(xì)胞特異性ATG16L1敲除在急、慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎癥的調(diào)節(jié)作用目的:探討ATG16L1對急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎癥的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:1)以灌胃法(3x10^6 cfu/小鼠)建立鼠傷寒沙門氏桿菌模型:10只雌性ATG16L1f/f和10只ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠分別于感染前一天,給予小鼠禁食水4小時后行鏈霉素20 mg/小鼠灌胃,以清除小鼠腸道的細(xì)菌,感染當(dāng)天以3x10^6 cfu鼠傷寒沙門氏桿菌/小鼠灌胃,分別于感染后第1、3、5天行DAI評分,并于感染后第5天處死小鼠。2)通過飲用3%右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate,DSS)7天成功建立急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,雌性ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠各10只;分別于實(shí)驗(yàn)的第2、4、6天行DAI評分,并于第7天處死小鼠。3)通過飲用2.5%DSS 28天成功建立慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在第1~5天、8~12天、15~19天和22~26天的時間段內(nèi)飲用4個循環(huán)2.5%的DSS,第27、28天及其它時間飲用蒸餾水。雌性ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠各10只;于每個循環(huán)的第1、3、5天行DAI評分,第29天處死動物。4)腸黏膜炎癥改變的評估包括每天體重(Body weight,BW)改變、疾病活動指數(shù)(Disease activity index,DAI)、結(jié)腸長度,以及結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變和病理評分;5)應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子腫瘤壞死因子(7)Tumor Necrosis Factor-a(11)TNF-a(8)、白介素-1b(Interleukin-1beta,IL-1b(8)和IL-6的表達(dá)水平。6)應(yīng)用細(xì)胞流式術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)來檢測CD4+T細(xì)胞的活化標(biāo)志物CD44和CD69的表達(dá)水平。7)檢測各模型小鼠糞便中Ig A+細(xì)菌的比例和糞便中Ig A的總量。8)細(xì)菌移位的測定:應(yīng)用涂菌法分別測定各種模型中糞便、回腸、結(jié)腸組織及MLN中的細(xì)菌數(shù)目。結(jié)果:1)鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:ATG16L1f/f小鼠和Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重逐漸下降,至感染后的第5天,ATG16L1f/f小鼠的體重下降至原始體重的95%,而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重下降至原始體重的86%。ATG16L1f/f小鼠的DAI評分為(6.3±0.41),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的DAI評分為(6.9±1.21,P0.05);Atg16L1f/f小鼠結(jié)腸大體評分(1.85±0.15)及結(jié)腸病理可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的結(jié)腸大體評分有所增加(2.13±0.14,P0.05),結(jié)腸病理可見黏膜缺損,腺體破壞或消失,杯狀細(xì)胞減少,可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量的炎性細(xì)胞浸潤,隱窩增生,并有隱窩炎癥及隱窩膿腫形成。與ATG16L1f/f小鼠比較,Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠結(jié)腸的病理評分有所增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.88±0.03vs5.50±0.72,P0.05)。2)3%DSS急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:給予3%DSS飲用水后,Atg16L1f/f小鼠和Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重逐漸下降,但是Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重下降較為明顯。Atg16L1f/f小鼠的DAI評分為(6.25±0.75),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的DAI評分為(8.6±0.41,P0.01)。ATG16L1f/f小鼠的結(jié)腸大體評分為(1.67±0.21)及結(jié)腸長度為(5.57cm±0.35 cm),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的結(jié)腸大體評分為(2.0±0)、結(jié)腸長度為(5.3cm±0.33cm),兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;結(jié)腸病理可見黏膜缺損,腺體破壞或消失,杯狀細(xì)胞減少,可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量淋巴細(xì)胞浸潤。與Atg16L1f/f小鼠比較,Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠病理評分明顯增高(10.67±1.17vs5.25±0.25,P0.01)。3)2.5%DSS慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:實(shí)驗(yàn)期間,給予2.5%DSS飲用水后,ATG16L1f/f小鼠和Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重出現(xiàn)下降,至實(shí)驗(yàn)的第14天體重下降至最低。之后,Atg16L1f/f小鼠的體重逐漸回升,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束回升至小鼠基礎(chǔ)體重的96%,而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重則回升為基礎(chǔ)體重的90%。在第29天ATG16L1f/f小鼠DAI評分降為(4.17±0.48),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的DAI為(7.33±0.33,P0.001)。與Atg16L1f/f小鼠相比,Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠結(jié)腸的大體評分(2.80±0.2vs1.60±0.20,P0.001)及病理評分明顯增加(10.37±1.00vs7.08±0.88,P0.01),結(jié)腸長度沒有變化(6.00cm±0.20 cm vs6.50cm±0.30 cm,P0.05),結(jié)腸病理可見黏膜缺損,腺體破壞或消失,杯狀細(xì)胞減少,可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量淋巴細(xì)胞浸潤。4)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:a.鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,腸黏膜固有層單個核細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1b、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(24.26 pg/m L±6.57 pg/m L,248.22 pg/m L±16.88 pg/m L,619.72 pg/m L±149.89 pg/m L),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,其炎癥因子的分泌水平明顯升高,分別為(51.54 pg/m L±5.22 pg/m L,290.44 pg/m L±48.88 pg/m L,922.55 pg/m L±147.70 pg/m L,P0.05);在Atg16L1f/f小鼠中,腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1b、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(13.63 pg/m L±1.85 pg/m L,244.58 pg/m L±27.30 pg/m L,320.90 pg/m L±233.68 pg/m L),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,其炎癥因子的分泌水平明顯升高,分別為(19.42 pg/m L±2.29 pg/m L,429.02 pg/m L±133.91pg/m L,497.40 pg/m L±129.90 pg/m L,P0.05)。b.3%DSS急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,腸黏膜固有層單個核細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1b、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(22.19 pg/m L±2.12 pg/m L,273.06 pg/m L±15.46 pg/m L,1153.9 pg/m L±102.84 pg/m L),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,其炎癥因子的分泌水平明顯升高,分別為(72.89pg/m L±5.19 pg/m L,363.93 pg/m L±14.80 pg/m L,1783.53 pg/m L±268.42pg/m L,P0.05);在Atg16L1f/f小鼠中,腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1b、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(0.78 pg/m L±0.28 pg/m L,229.24 pg/m L±50.82 pg/m L,728.00 pg/m L±64.10 pg/m L),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,其炎癥因子的分泌水平明顯升高,分別為(2.48 pg/m L±0.134 pg/m L,1126.60 pg/m L±19.07 pg/m L,1307.92 pg/m L±74.74pg/m L,P0.05)。c.2.5%DSS慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,腸黏膜固有層單個核細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1b、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(24.76 pg/m L±2.03 pg/m L,137.75 pg/m L±15.08 pg/m L,1601.06 pg/m L±202.12 pg/m L),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,其炎癥因子的分泌水平明顯升高,分別為(59.58 pg/m L±7.41 pg/m L,441.40pg/m L±19.43 pg/m L,2942.92 pg/m L±438.95 pg/m L,P0.05);在Atg16L1f/f小鼠中,細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1b、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(6.61 pg/m L±1.60 pg/m L,229.02 pg/m L±29.22 pg/m L,403.54 pg/m L±122.88 pg/m L),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,其炎癥因子的分泌水平明顯升高,分別為(19.46 pg/m L±3.34 pg/m L,324.14 pg/m L±41.41 pg/m L,1017.62 pg/m L±90.92 pg/m L),兩組間炎癥因子分泌的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5)提取MLN單個核細(xì)胞,應(yīng)用細(xì)胞流式術(shù)檢測CD4細(xì)胞活化標(biāo)準(zhǔn)物CD44和CD69,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:a.鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,晚期活化的CD44+CD4+T細(xì)胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細(xì)胞百分比為(12.2%±1.2%,12.9%±2.4%),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,晚期活化的CD44+CD4+T細(xì)胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細(xì)胞百分比為(10.3%±1.2%,12.75%±2.3%),兩組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);b.3%DSS急性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,晚期活化的CD44+CD4+T細(xì)胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細(xì)胞百分比為(11.7%±1.2%,9.28%±2.1%),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,晚期活化的CD44+CD4+T細(xì)胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細(xì)胞百分比為(9.75%±2.1%,8.42%±1.5%),兩組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);c.2.5%DSS慢性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,晚期活化的CD44+CD4+T細(xì)胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細(xì)胞百分比為(24.3%±1.1%,9.8%±0.9%),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中,晚期活化的CD44+CD4+T細(xì)胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細(xì)胞百分比(22.7%±2.2%,7.84%±1.0%),兩組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);6)Ig A+細(xì)菌的檢測結(jié)果:a.鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,Ig A+細(xì)菌的比例為(11.53%±2.42%),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的Ig A+細(xì)菌的比例為(44.00%±9.51%),兩組間Ig A+細(xì)菌的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。b.3%DSS急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,Ig A+細(xì)菌的比例為(12.98%±0.62%),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中Ig A+細(xì)菌的比例上升,為(19.43%±0.77%),兩組間Ig A+細(xì)菌的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。c.2.5%DSS慢性實(shí)驗(yàn)性模型:在給予DSS飲用水之前,收集小鼠的糞便,進(jìn)行Ig A染色。在Atg16L1f/f小鼠中,Ig A+細(xì)菌的比例為(2.98%±0.65%),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中Ig A+細(xì)菌的比例明顯上升,為(5.84%±0.87%),兩組間Ig A+細(xì)菌的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第2周,與Atg16L1f/f小鼠相比,Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中Ig A+細(xì)菌的比例上升,Ig A+細(xì)菌的比例為(19.43%±2.77%vs15.68%±1.60%,P0.01);到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,與Atg16L1f/f小鼠相比,Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中Ig A+細(xì)菌的比例上升(32.88%±3.20%vs28.65%±4.18%,P0.05)。7)鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,糞便中Ig A總量為(1100μg/g±24.2μg/g),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便中Ig A總量為(2850μg/g±33μg/g),兩組間Ig A總量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3%DSS急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,糞便中Ig A總量為(70μg/g±5.6μg/g),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便中Ig A總量為(81μg/g±9.2μg/g),兩組間Ig A總量的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2.5%DSS慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,糞便中Ig A總量為(48μg/g±3.2μg/g),而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便中Ig A總量為(50μg/g±8.3μg/g),兩組間Ig A總量的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8)鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,糞便中細(xì)菌的數(shù)量為(1674x10^6 cfu/g±169 x10^6 cfu/g),回腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(201.50 x10^3cfu/g±137 x10^3 cfu/g),結(jié)腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(170.80x10^3 cfu/g±33 x10^3 cfu/g),腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量為(198 cfu/g±28.20cfu/g);而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便細(xì)菌的數(shù)量為(2584 x10^6 cfu/g±590x10^6 cfu/g),回腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(529.3 x10^3 cfu/g±354.6 x10^3cfu/g),結(jié)腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(246.9x10^3 cfu/g±91 x10^3 cfu/g),腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量為(369 cfu/g±112 cfu/g),兩組間糞便中、回腸、結(jié)腸組織及腸系膜淋巴結(jié)中細(xì)菌的數(shù)量差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3%DSS急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,糞便中細(xì)菌的數(shù)量為(2.20 x10^6 cfu/g±0.50x10^6 cfu/g),腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量為(20 cfu/g±2.00 cfu/g);而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便細(xì)菌的數(shù)量為(10.7x10^6 cfu/g±1.71x10^6 cfu/g),腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量為(36cfu/g±1.10 cfu/g),兩組間糞便及腸系膜淋巴結(jié)中細(xì)菌的數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2.5%DSS慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型:在Atg16L1f/f小鼠中,糞便中細(xì)菌的數(shù)量為(27.33 x10^6 cfu/g±1.23 x10^6 cfu/g),回腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(37 x10^3 cfu/g±1.37 x10^3 cfu/g),結(jié)腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(36x10^3 cfu/g±3.30 x10^3 cfu/g),腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量為(18cfu/g±2.80 cfu/g);而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便細(xì)菌的數(shù)量為(435.51x10^6 cfu/g±43.9 x10^6 cfu/g),回腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(89 x10^3cfu/g±3.54 x10^3 cfu/g),結(jié)腸組織中的細(xì)菌數(shù)量為(246 x10^3 cfu/g±71x10^3 cfu/g),腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌數(shù)量為(76 cfu/g±8.4 cfu/g),兩組間糞便中、回腸、結(jié)腸組織級腸系膜淋巴結(jié)中細(xì)菌的數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.2-7C)。第三部分:樹突狀細(xì)胞特異性ATG16L1敲除對小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞功能的影響目的:研究ATG16L1對小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法:分別應(yīng)用饑餓培養(yǎng)基(EBSS)及鼠傷寒沙門氏桿菌(salmonella)感染這2種刺激條件誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,將實(shí)驗(yàn)分為4組:control組;salmonella組;starvation(EBSS)組;starvation+salmonella組。1)采用western blot技術(shù)檢測骨髓來源的樹突狀細(xì)胞中LC3I、LC3II和P40的表達(dá)水平。2)通過自噬功能檢測實(shí)驗(yàn)包括活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的檢測、細(xì)菌吞噬試驗(yàn)和慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)來檢測樹突狀細(xì)胞處理細(xì)菌的功能。3)通過透射電鏡來檢測細(xì)胞中自噬小體和吞噬小體的形成情況以及線粒體的數(shù)量。4)采用免疫熒光染色法來檢測鼠傷寒沙門氏桿菌的定位情況。5)采用抗原呈提實(shí)驗(yàn)來檢測樹突狀細(xì)胞的抗原處理和呈提能力的變化。結(jié)果:1)western blot技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在ATG16L1f/f樹突狀細(xì)胞中,LC3I完全轉(zhuǎn)換為LC3II,尤其在鼠傷寒沙門氏桿菌感染和饑餓狀態(tài)的雙重誘導(dǎo)后,LC3II的轉(zhuǎn)換上升至最高。而樹突狀細(xì)胞特異性敲除ATG16L1后,在各種刺激因素誘導(dǎo)自噬的條件下,Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞沒有LC3II的表達(dá)。2)自噬功能檢測實(shí)驗(yàn)表明:在正常培養(yǎng)基條件下,加入鼠傷寒沙門氏桿菌后,與Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞相比,Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞在加入鼠傷寒沙門氏桿菌1h之內(nèi)產(chǎn)生的ROS明顯較多,細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的能力明顯降低(感染后1h和4h),但是兩種細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力在感染后15 min、30 min和60 min后均沒有差異;應(yīng)用饑餓培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。3)透射電鏡結(jié)果顯示:每個Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量明顯較Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞的數(shù)量增多,而吞噬小體的數(shù)量明顯減少,兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而且與Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞相比,Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞中的線粒體的數(shù)量明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4)免疫熒光檢測結(jié)果顯示:Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞中鼠傷寒沙門氏桿菌與beclin-1的共定位與Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞中的共定位數(shù)量沒有差別。在Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞中,ATG16L1與LC3的共定位數(shù)量高達(dá)40%,而在Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞中,沒有ATG16L1的表達(dá)。與Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細(xì)胞相比,Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞中鼠傷寒沙門氏桿菌與Lamp1的共定位數(shù)量較多,鼠傷寒沙門氏桿菌與rab5、rab7的共定位數(shù)量明顯減少(P0.05);應(yīng)用饑餓培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。5)抗原呈提實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:給予Ova-peptide刺激后,Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力和Atg16L1f/f DC-Cre樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即幼稚CD4+T cells的增值百分比分別為(92.6%±4.6%vs91.4%±5.3%,P0.05),而給予Ova-protein刺激后,與Atg16L1f/f樹突狀細(xì)胞相比,Atg16L1f/f DC-Cre樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力下降(81.7%±2.6%vs65.8%±1.7%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1在成功建立急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型基礎(chǔ)上,證實(shí)樹突狀細(xì)胞特異性敲除ATG16L1基因可明顯加重DSS誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜炎癥,而對鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型無影響;2樹突狀細(xì)胞特異性敲除ATG16L1基因通過上調(diào)腸系膜淋巴結(jié)和腸黏膜固有層中單個核細(xì)胞中IL-1?、TNF-α和IL-6的分泌水平,加重DSS誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜炎癥;3樹突狀細(xì)胞特異性敲除ATG16L1基因可抑制自噬小體的形成,增加ROS的生成,抑制胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏桿菌的清除,證實(shí)敲除ATG16L1基因可抑制骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞的自噬功能;4 ATG16L1維持細(xì)胞的抗原處理能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1698850