本文選題：非酒精性脂肪性肝病　切入點(diǎn)：高脂飲食　出處：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的：建立高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型,并明確其病理生理變化。 方法：選取雄性C57BL/6J小鼠60只,隨機(jī)分為正常飲食組和進(jìn)食高脂飼料組(42%脂肪供能),每組30只。持續(xù)喂養(yǎng)24周,分別于造模12周、16周、20周和24周各組隨機(jī)抽取5只動(dòng)物處死。觀察體重、肝臟濕重和肝臟組織學(xué)的變化。心臟取血檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)和空腹血糖(Glu)的變化。SABC免疫組化技術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織中CD68的變化。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織中c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)的表達(dá)水平。 結(jié)果：從12周開始,HE染色顯示超過70%的高脂飼養(yǎng)小鼠的肝臟發(fā)生了脂肪變,到20周所有高脂飲食組小鼠的肝臟均發(fā)生了脂肪變,其肝臟脂肪變的程度未隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯加重。油紅O染色顯示高脂飲食組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的橘紅色脂滴。從12周開始高脂飲食組小鼠體重、肝臟濕重明顯高于正常飲食組小鼠(P0.05)。高脂小鼠血清ALT、TG和Glu的水平逐漸升高,并從16周開始與正常飲食小鼠相比有顯著差異(P0.05)。而高脂飲食組血清Alb水平逐漸降低。免疫組化染色顯示高脂飲食小鼠肝臟組織中CD68的表達(dá)較正常飲食組增加。RT-PCR顯示在喂養(yǎng)24周后高脂飲食小鼠肝組織中JNKl的表達(dá)量是正常飲食組的3-7倍。 結(jié)論：高脂飲食飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠12～24周可成功構(gòu)建NAFLD模型,該模型的特征為肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗和肝臟脂肪變。高脂飲食能激活肝組織JNK1的表達(dá),誘導(dǎo)和加重肝臟的胰島素抵抗。 目的：研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型和患者肝穿標(biāo)本肝臟中脂肪細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)變化及意義。 方法：對(duì)高脂飲食造模的雄性C57BL/6J小鼠及正常飲食的同種小鼠分別在12周、16周、20周和24周運(yùn)用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中脂肪細(xì)胞標(biāo)志物的變化：脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、過氧化物酶體增殖物激活受體y (PPARγ)、 CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPa)和脂聯(lián)素(adiponectin)。Western blot技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-Cadherin的表達(dá)。對(duì)16例肝穿病理診斷脂肪肝患者和10例正常肝組織石蠟包埋標(biāo)本行切片及SABC免疫組化染色檢測(cè)PPARy的表達(dá)定位,并應(yīng)用免疫熒光雙重染色技術(shù)明確脂肪細(xì)胞標(biāo)志物aP2在NAFLD患者肝組織中的表達(dá)定位。 結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高脂飲食組小鼠在喂養(yǎng)24周過程中肝臟aP2和PPARy的表達(dá)較正常飲食組小鼠分別增加了2-3倍和4-9倍,Western blot也顯示了其同樣的變化。而高脂飲食組小鼠肝臟C/EBPa和adiponectin的mRNA表達(dá)較正常飲食組小鼠降低,僅C/EBPa在喂養(yǎng)24周時(shí)表達(dá)較正常飲食組升高約1.4倍,Western blot檢測(cè)也顯示了高脂飲食組C/EBPa和adiponectin蛋白的表達(dá)均較正常飲食組降低。肝臟組織中E-Cadherin蛋白的表達(dá)在高脂飲食組隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減低。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)PPARy在NAFLD患者肝臟中表達(dá)增加,并主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。組織切片免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示NAFLD患者肝臟中有aP2表達(dá),并且aP2與白蛋白的表達(dá)位置重疊,均出現(xiàn)在肝細(xì)胞胞漿內(nèi),而白蛋白的表達(dá)明顯較對(duì)照組降低。 結(jié)論：在高脂飲食小鼠NAFLD模型和NAFLD患者肝臟中,我們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)部分脂肪細(xì)胞特異性蛋白,即發(fā)生了成脂性改變,而其自身上皮細(xì)胞表型和分泌功能均降低。 目的：研究原代分離的脂肪變肝細(xì)胞對(duì)kupffer細(xì)胞系RAW264.7活化的影響。 方法：在高脂飲食組和正常飲食組均喂養(yǎng)到20周時(shí),利用膠原酶灌流+低速等密度percoll離心法分離培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞。油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞的脂肪變情況。免疫熒光染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪細(xì)胞標(biāo)志物aP2和上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的變化。原代分離的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時(shí)后,在transwell小室中與6孔板內(nèi)的kupffer細(xì)胞系共培養(yǎng)。共培養(yǎng)48小時(shí)后,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、MCP-1、 IL-6、IL-18的變化。CFSE染色kupffer細(xì)胞及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其增殖情況。Western blot檢測(cè)kupffer細(xì)胞CD68表達(dá)的變化。 結(jié)果：油紅O染色可顯示高脂飲食組小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)存在大量橘紅色脂滴。免疫熒光雙重染色可見高脂飲食組小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)脂肪細(xì)胞標(biāo)志物aP2與白蛋白(Alb)共定位,并且其Alb和E-cadherin的表達(dá)均較正常飲食組降低。共培養(yǎng)48小時(shí)后,脂肪變肝細(xì)胞+kupffer細(xì)胞組的細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-18的表達(dá)較其他對(duì)照組明顯升高(P0.05),并且脂肪變肝細(xì)胞自身也能分泌炎癥因子。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE染色與脂肪變肝細(xì)胞共培養(yǎng)的kupffer細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖。Western blot檢測(cè)脂肪變肝細(xì)胞+kupffer細(xì)胞組共培養(yǎng)的kupffer細(xì)胞CD68蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P0.05)。 結(jié)論：成脂性改變的肝細(xì)胞雖然其自身分泌功能和上皮細(xì)胞表型被削弱,但是能分泌細(xì)胞因子,并能在體外刺激kupffer細(xì)胞的活化,促進(jìn)其增殖,從而共同參與了脂肪性肝炎的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1692975