本文選題：非酒精性脂肪性肝病　切入點：高脂飲食　出處：《華中科技大學》2014年博士論文

【摘要】：目的：建立高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型,并明確其病理生理變化。 方法：選取雄性C57BL/6J小鼠60只,隨機分為正常飲食組和進食高脂飼料組(42%脂肪供能),每組30只。持續(xù)喂養(yǎng)24周,分別于造模12周、16周、20周和24周各組隨機抽取5只動物處死。觀察體重、肝臟濕重和肝臟組織學的變化。心臟取血檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)和空腹血糖(Glu)的變化。SABC免疫組化技術檢測小鼠肝組織中CD68的變化。運用RT-PCR技術檢測肝組織中c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)的表達水平。 結果：從12周開始,HE染色顯示超過70%的高脂飼養(yǎng)小鼠的肝臟發(fā)生了脂肪變,到20周所有高脂飲食組小鼠的肝臟均發(fā)生了脂肪變,其肝臟脂肪變的程度未隨著喂養(yǎng)時間的延長而明顯加重。油紅O染色顯示高脂飲食組小鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的橘紅色脂滴。從12周開始高脂飲食組小鼠體重、肝臟濕重明顯高于正常飲食組小鼠(P0.05)。高脂小鼠血清ALT、TG和Glu的水平逐漸升高,并從16周開始與正常飲食小鼠相比有顯著差異(P0.05)。而高脂飲食組血清Alb水平逐漸降低。免疫組化染色顯示高脂飲食小鼠肝臟組織中CD68的表達較正常飲食組增加。RT-PCR顯示在喂養(yǎng)24周后高脂飲食小鼠肝組織中JNKl的表達量是正常飲食組的3-7倍。 結論：高脂飲食飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠12～24周可成功構建NAFLD模型,該模型的特征為肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗和肝臟脂肪變。高脂飲食能激活肝組織JNK1的表達,誘導和加重肝臟的胰島素抵抗。 目的：研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型和患者肝穿標本肝臟中脂肪細胞特異性蛋白的表達變化及意義。 方法：對高脂飲食造模的雄性C57BL/6J小鼠及正常飲食的同種小鼠分別在12周、16周、20周和24周運用RT-PCR和Western blot技術檢測肝臟組織中脂肪細胞標志物的變化：脂肪細胞脂肪酸結合蛋白(aP2)、過氧化物酶體增殖物激活受體y (PPARγ)、 CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBPa)和脂聯(lián)素(adiponectin)。Western blot技術檢測肝臟組織中上皮細胞的標志蛋白E-Cadherin的表達。對16例肝穿病理診斷脂肪肝患者和10例正常肝組織石蠟包埋標本行切片及SABC免疫組化染色檢測PPARy的表達定位,并應用免疫熒光雙重染色技術明確脂肪細胞標志物aP2在NAFLD患者肝組織中的表達定位。 結果：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),高脂飲食組小鼠在喂養(yǎng)24周過程中肝臟aP2和PPARy的表達較正常飲食組小鼠分別增加了2-3倍和4-9倍,Western blot也顯示了其同樣的變化。而高脂飲食組小鼠肝臟C/EBPa和adiponectin的mRNA表達較正常飲食組小鼠降低,僅C/EBPa在喂養(yǎng)24周時表達較正常飲食組升高約1.4倍,Western blot檢測也顯示了高脂飲食組C/EBPa和adiponectin蛋白的表達均較正常飲食組降低。肝臟組織中E-Cadherin蛋白的表達在高脂飲食組隨著喂養(yǎng)時間的延長逐漸減低。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)PPARy在NAFLD患者肝臟中表達增加,并主要表達于細胞核內(nèi)。組織切片免疫熒光雙重染色結果顯示NAFLD患者肝臟中有aP2表達,并且aP2與白蛋白的表達位置重疊,均出現(xiàn)在肝細胞胞漿內(nèi),而白蛋白的表達明顯較對照組降低。 結論：在高脂飲食小鼠NAFLD模型和NAFLD患者肝臟中,我們發(fā)現(xiàn)肝細胞內(nèi)可表達部分脂肪細胞特異性蛋白,即發(fā)生了成脂性改變,而其自身上皮細胞表型和分泌功能均降低。 目的：研究原代分離的脂肪變肝細胞對kupffer細胞系RAW264.7活化的影響。 方法：在高脂飲食組和正常飲食組均喂養(yǎng)到20周時,利用膠原酶灌流+低速等密度percoll離心法分離培養(yǎng)小鼠原代肝細胞。油紅O染色檢測肝細胞的脂肪變情況。免疫熒光染色檢測肝細胞內(nèi)脂肪細胞標志物aP2和上皮細胞標志物E-cadherin的變化。原代分離的肝細胞體外培養(yǎng)24小時后,在transwell小室中與6孔板內(nèi)的kupffer細胞系共培養(yǎng)。共培養(yǎng)48小時后,ELISA法檢測細胞上清液中炎癥因子TNF-α、MCP-1、 IL-6、IL-18的變化。CFSE染色kupffer細胞及流式細胞術檢測其增殖情況。Western blot檢測kupffer細胞CD68表達的變化。 結果：油紅O染色可顯示高脂飲食組小鼠原代肝細胞內(nèi)存在大量橘紅色脂滴。免疫熒光雙重染色可見高脂飲食組小鼠原代肝細胞內(nèi)脂肪細胞標志物aP2與白蛋白(Alb)共定位,并且其Alb和E-cadherin的表達均較正常飲食組降低。共培養(yǎng)48小時后,脂肪變肝細胞+kupffer細胞組的細胞上清液中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-18的表達較其他對照組明顯升高(P0.05),并且脂肪變肝細胞自身也能分泌炎癥因子。流式細胞術檢測CFSE染色與脂肪變肝細胞共培養(yǎng)的kupffer細胞出現(xiàn)明顯增殖。Western blot檢測脂肪變肝細胞+kupffer細胞組共培養(yǎng)的kupffer細胞CD68蛋白的表達量較對照組明顯升高(P0.05)。 結論：成脂性改變的肝細胞雖然其自身分泌功能和上皮細胞表型被削弱,但是能分泌細胞因子,并能在體外刺激kupffer細胞的活化,促進其增殖,從而共同參與了脂肪性肝炎的發(fā)生。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

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本文編號：1692975