發(fā)布時(shí)間：2018-03-31 13:17

  本文選題：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　切入點(diǎn)：未折疊蛋白反應(yīng)　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種臨床常見的急腹癥。臨床上大多數(shù)患者為自限性的輕度AP(mild acute pancreatitis,MAP);但仍約有20%~30%的患者發(fā)病即為或者遷延為重度AP(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP以全身性炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)為特點(diǎn)。AP中胰腺的損傷主要表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞的凋亡和壞死。壞死的細(xì)胞大量釋放細(xì)胞因子及炎性介質(zhì),而凋亡是通過形成凋亡小體實(shí)現(xiàn)程序性的細(xì)胞死亡,避免了細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。因此,關(guān)于如何使誘導(dǎo)發(fā)生炎癥的腺泡細(xì)胞提前凋亡,避免AP病情遷延加重的研究已經(jīng)成為近年來的熱點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的過程。多種理化因素都能夠?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡,繼而引起ERS的發(fā)生。未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)是ERS的主要應(yīng)答機(jī)制,通過PERK/e IFα、IRE1/XBP1、ATF6三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控,以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)至穩(wěn)態(tài)。同時(shí),若ERS過度強(qiáng)力并且持久,受損的細(xì)胞也會(huì)發(fā)生凋亡。X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)能夠上調(diào)ER分子伴侶的基因表達(dá)并加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白的能力,在UPR中的地位最關(guān)鍵。胰腺腺泡細(xì)胞對(duì)ERS非常易感。ERS及UPR在AP的發(fā)病及進(jìn)展階段都有參與。敲除XBP1的腺泡細(xì)胞將會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)缺失及廣泛凋亡,而在已經(jīng)發(fā)生AP的腺泡細(xì)胞中,對(duì)于XBP1的干預(yù)作用是否能夠在早期即誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞凋亡,從而避免炎癥加重而進(jìn)展為細(xì)胞壞死,目前國內(nèi)外尚無明確報(bào)道。目的:采用RNAi技術(shù)對(duì)AR42J細(xì)胞XBP1基因表達(dá)敲低,應(yīng)用雨蛙素、雨蛙素聯(lián)合脂多糖兩種方式分別處理AR42J細(xì)胞建立不同程度的AP離體細(xì)胞模型,探究XBP1蛋白的表達(dá)量下調(diào)對(duì)于AP胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響。方法:隨機(jī)設(shè)計(jì)并合成針對(duì)大鼠XBP1的小干擾RNA(small interference RNA,si RNA)3條(XBP1-303、XBP1-684、XBP1-808)及與XBP1基因無同源性無意義si RNA(negative control si RNA)。在lipofectamine 2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞,RT-PCR檢測(cè)XBP1 m RNA表達(dá)篩選出沉默效果好的XBP1 si RNA,以此si RNA再次轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞,并于轉(zhuǎn)染后48h分別予以雨蛙素(CAE組)、雨蛙素聯(lián)合脂多糖(CAE+LPS組)、正常培養(yǎng)液(Negative control組)處理。依據(jù)造模后時(shí)間分別于4h、8h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)為亞組收集細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞CHOP m RNA表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞caspase-12表達(dá)水平以及24h亞組GRP78表達(dá)水平,Annexin V-FITC/PI雙染聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)造模后24h細(xì)胞凋亡及壞死比例。結(jié)果:1 XBP1 m RNA表達(dá):XBP1-303轉(zhuǎn)染后的AR42J細(xì)胞XBP1 m RNA表達(dá)量在各組中最低。2CHOP m RNA表達(dá):CAE+LPS處理4h后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CHOP表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P0.05);而處理8h及24h后,未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組之間均無明顯差異(P0.05);CAE處理的細(xì)胞,各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的CHOP m RNA表達(dá)量均明顯高于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(P0.05)。CAE+LPS處理后的細(xì)胞的CHOP m RNA表達(dá)量明顯高于CAE處理后細(xì)胞,CAE處理后的細(xì)胞的CHOP m RNA表達(dá)量又明顯高于對(duì)照組的細(xì)胞(P0.05)。CAE+LPS處理后的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的CHOP m RNA表達(dá)量明顯高于其它所有組(P0.05)。3 GRP78的表達(dá):未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組可見GRP78極少量表達(dá),而轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組表達(dá)量明顯高于前者(P0.05)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAE組與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAE+LPS組的表達(dá)量有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),同樣均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組表達(dá)量(P0.05)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CAE組及CAE+LPS組表達(dá)量有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),同樣均明顯高于其余各組(P0.05)。4 Caspase-12的表達(dá):依據(jù)XBP1是否敲低比較:CAE+LPS處理4h、8h及24h后,轉(zhuǎn)染組表達(dá)量均明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P0.05);而隨著時(shí)間的進(jìn)展,其表達(dá)量均在8h時(shí)達(dá)到高峰,在24h的表達(dá)量與8h并無明顯差異(P0.05)。CAE處理的細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)量同樣均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P0.05);而它們各自的表達(dá)量的高低與處理后時(shí)間的進(jìn)展并無顯著聯(lián)系;對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)量同樣均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P0.05),隨著時(shí)間進(jìn)展也并無明顯變化。依據(jù)處理程度比較,CAE+LPS組的細(xì)胞無論轉(zhuǎn)染還是未轉(zhuǎn)染,除4h時(shí)間點(diǎn)外,8h及24h其表達(dá)量均明顯高于CAE組(P0.05)。XBP1基因是否敲低與處理AR42J細(xì)胞的程度也同樣具有交互作用(P0.05),可認(rèn)為CAE+LPS處理組的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的ERS相關(guān)凋亡水平明顯高于其它所有組。5 Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡及壞死比例:轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在CAE處理24 h后,凋亡細(xì)胞比例明顯高于同處理下未轉(zhuǎn)染組(P0.05);而在CAE+LPS處理24h后,凋亡比例明顯高于同處理未轉(zhuǎn)染組(P0.05),壞死比例也是明顯低于同處理未轉(zhuǎn)染組(P0.05);對(duì)照組細(xì)胞,轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P0.05),壞死比例則無明顯差異(P0.05)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAE+LPS組其壞死細(xì)胞及凋亡細(xì)胞比例均明顯高于CAE組(P0.05),而CAE組凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例又均明顯高于對(duì)照組(P0.05)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAE+LPS組其壞死細(xì)胞及凋亡細(xì)胞比例均明顯高于CAE組(P0.05),而CAE組凋亡細(xì)胞比例又明顯高于對(duì)照(P0.05),壞死細(xì)胞比例則無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1成功地分別應(yīng)用CAE建立了MAP模型,CAE+LPS建立了SAP模型。2 ERS明確參與了AP的疾病進(jìn)展過程。3敲低XBP1表達(dá)后所產(chǎn)生的ERS介導(dǎo)的凋亡,能夠使發(fā)生AP時(shí)壞死細(xì)胞的比例明顯減少,因而可能減輕AP的嚴(yán)重程度。這一效應(yīng)在SAP中更為顯著。4 XBP1是ERS應(yīng)答機(jī)制中的一個(gè)重要因子,它能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù),減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。對(duì)XBP1的沉默能夠加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R576

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本文編號(hào)：1690903